1、新生兒促甲狀腺素的時間分辨熒光免疫分析及其試劑盒研制譚玉華，馮健明，盧順舵，羅建安，李建國，季濤，李貴情廣州市豐華生物工程，廣州 510730 摘要：目的 利用時間分辨熒光免疫分析TrFIA技術，建立新生兒促甲狀腺素Neonatal TSH微量檢測法，并研制其檢測試劑盒。方法 采用了一株TSH單克隆抗體用于固相包被，另一株TSH單克隆抗體用于標記銪Eu3+，固相雙抗體夾心時間分辨熒光免疫分析法檢測Neonatal TSH。結果 自建的Neonatal hTSH TrFIA法靈敏度高可達2.28µU/ml，且在測量范圍內，自制試劑盒劑量-反響曲線的相關系數r 達0.9987。與hLH、

2、hFSH、HCG無明顯交叉反響。分析內或分析間質控結果在靶值±25%內，室內低質控、高質控分析內和分析間變異系數(CV)分別為7.12%和6.09%，7.82%和7.03%。與DELFIA ® Neonatal TSH試劑標準品進行準確性比對實測值與標示效價比平均值為1.05。與DELFIA ® Neonatal TSH試劑比對試驗符合率一致，相關性系數r可達0.9822。試劑盒室間質評能力比對成績100%。結論 自建的Neonatal TSH TrFIA法具有靈敏度高，特異性強，準確度高，精密性好和非放射性等優點，具有良好的臨床應用價值。關鍵詞：新生兒；促甲狀腺

3、素；時間分辨熒光免疫分析Time-resolved Fluoroimmunoassay of Neonatal Hypothyropin and Preparation of Its Test ReagentTan Yu-hua,Feng Jian-ming, Lu Shun-duo, Luo Jian-an, Li Jian-guo, Ji Tao,Li Gui-qing( Guang zhou Fenghua Bio-engineering Co.,LTD,Guangzhou 510730 China)Abstract: Objective To establish a method of

4、 Time-resolved Fluoroimmunoassay(TrFIA) for the quantitative determination of human thyroid stimulating hormone(hTSH) in blood specimens dired on filter paper as an aid in screening newborns for neonatal hypothyroidism,and to prepare its test reagent .Methods The method based on solidphase sandwich

5、TrFIA for Neonatal Hypothyropin(Neo-hTSH),which used two anti-TSH monoclonal antibody -one was coated on microplates and another was labeled by Europium. Results The assay sensitivity of the method was 2.28µU/ml.The correlation coefficient of self made kits curve was 0.9987.There was no obvious

6、 cross-reaction to human luteinizing hormone(hLH) , human follicle stimulating(hFSH) and human chorionic gonadotropin(HCG).The intra-assay and the inter-assay measured values of controls were not more than 25% difference from their labeled values, still their intra-assay and the inter-assay coeffici

7、ents of variation(CV) of low and high controls were 7.12% and 6.09%, 7.82% and 7.03%,respectively. The correlation coefficient of self made Kit and DELFIA ® Neonatal TSH kit was 0.9822,and the results of self made Kit and DELFIA ® Neonatal TSH kit were showing no difference. The labs profi

8、ciency testing was excellent. Conclusions The Neonatal TSH TrFIA established which has several advantages including high sensitivity, strong specificity, good accuracy, nice precision, and non-radioactive immunoassay. It is suitable for clinical use.資料個人收集整理，勿做商業用途Key words: Neonatal; Hypothyropin;

9、Time-resolved Fluoroimmunoassay新生兒血液中促甲狀腺素Neonatal TSH濃度升高(出生72小時后采血)是原發性甲狀腺功能低下癥CH最早的實驗指標。CH是造成兒童智力低下和生長發育緩慢的重要疾病之一。通過新生兒篩查，可及早診斷和阻斷疾病開展，預防腦損傷的發生。國內由于篩查技術的滯后，新生兒疾病的篩查尚待普及。國內外資料說明開展和推廣新生兒疾病的篩查，其經濟意義和社會意義日益顯著。隨著?中華人民共和國母嬰保健法?的公布，對依法進行新生兒疾病篩查提供了有效的法律和政策支持。并且TrFIA法為衛生部新生兒疾病篩查質控中心推薦的首選方法1。經過多年研究，我們建立了Ne

10、o-hTSH TrFIA法，并研制出了診斷試劑盒，現報道如下。1 材料與方法1.1 標本 標本均在受試者知情同意下通過S&S903濾紙收集，嚴格按要求操作2-4，由鄭州大學第三附屬醫院、沈陽市婦幼保健所新篩中心、佛山市順德區婦幼保健院提供。1.2 材料與儀器 分別用于包被和標記的兩株鼠源性促甲狀腺素單克隆抗體進口分裝，TSH純品、牛血清白蛋白BSA和Tween80Sigma公司。Sepharose CL-6BPharmacia公司。96孔微孔板Thermo Labsystems公司。銪(Eu3+)標記試劑盒Wallac公司。-萘甲酰三氟丙酮為主要成分的Eu3+發光增強液5、洗滌液6和含

11、有小牛血清(200ml/L)的50mmol/L pH7.80Tris-HCl溶液為分析緩沖液6均為自制。其余試劑為國產分析純試劑。凍干機上海浦東冷凍枯燥設備。VictorTM2D1420型TrFIA檢測儀及配套DELFIA ® Neonatal TSH試劑Perkin Elmer公司。恒溫振蕩儀廣州豐華公司。1.3 標準血片、質控血片制備 用TSH純品按50-55%的血細胞比容由人全血制備，由本公司生產部提供。1.4 固相抗體包被板的制備 將包被抗體用50mmol/L pH4.6檸檬酸緩沖液稀釋至3.00µg/ml，在96孔微孔板各孔中加200µl，4過夜，棄去包

12、被液，洗滌1次，每孔加280µl含有10.0g/L BSA的10mmol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，37封閉2h，棄去封閉液，真空抽干過塑冷藏。1.5 銪標記物的制備 將1mg的標記抗體參加含有1mg的Eu3+凍干粉小瓶中，室溫振蕩反響48h。反響液經用50mmol/L pH7.80Tris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱1cm×40cm層析，A280監測收集第一洗脫峰。1.6 建立Neo-hTSH TrFIA檢測方法 采用雙抗體夾心法，將標準品、質控品或樣本用打孔器打下直徑約3.2mm樣品盤于固相抗體包被板中，再參加用分析緩沖液1：1200稀釋的銪標

13、記物 200µl室溫振蕩4h室溫法或室溫振蕩15min后置于4過夜孵育再室溫振蕩1h過夜法，洗滌6次，參加增強液200µl ，振蕩5min后，于1420時間分辨儀上用隨機配備的Workstation軟件熒光計數和用Multicalc軟件進行擬合分析。1.7 Perkimelmer公司DELFIA ® Neonatal TSH檢測方法嚴格按儀器和試劑說明書操作檢測。1.8 評價參數 評價試劑盒的分析靈敏度、分析特異性、準確性、精密度，建立試劑盒的參考值，并與國外同類產品進行比對試驗。1.9 統計學處理 Neonatal TSH TrFIA標準曲線分析有效劑量ED、變

14、異系數CV等及結果由VictorTM2D1420儀隨機配備Multicalc軟件自動給出。其它平行對照實驗均采用配對t檢驗分析或直線相關性分析。測試值與靶值間采用偏倚分析。2 結果2.1 上述包被抗體濃度、包被與封閉溫度與時間7、反響溫度與時間7-8、銪標記物工作濃度、洗板次數等均采用棋盤方陣滴配法確定。2.2 方法學評價參數 劑量反響曲線 采用LIN-MEAS擬合模式，繪制標準曲線如圖1。在測量范圍內，自制試劑盒劑量-反響曲線的相關系數r 達0.9987。圖1 自制試劑盒劑量-反響曲線 分析靈敏度 以自制試劑1 µU/mL全血標準品重復檢測20次，以x +2s的熒光值在曲線上得到相

15、應濃度為檢測低限，那么本方法的檢測低限可達2.28µU/ml。 特異性 自制試劑檢測含有250U/L的hLH、250U/L的hFSH、100000U/L的HCG樣品，其表觀值均小于2.5µU/ml。 準確性與精密性 自制試劑盒檢測DELFIA ® Neonatal TSH試劑標準品，實測值10次檢測平均值與標示效價比平均值為1.05。取本公司制備的質控品C1和C2，進行分析內 (10次)和分析間實驗(10次) ，分析內或分析間質控結果在靶值±25%內，分析內CV<15%，分析間CV<20%。結果詳見表1。表1 自制Neonatal TSH試劑

16、盒的精密性質控 靶值uU/ml 接受范圍 uU/ml x批內 uU/ml x批間 uU/ml CV批內% CV 批間% C1 13.4 10.1-16.8 13.71 14.29 7.12 7.82 C2 59.2 53.39 54.94 6.09 7.03 參考值 1690例正常新生兒足跟干血片用自制試劑盒測定，Neonatal TSH結果呈正偏態分布，結果詳見表2。經統計學處理，最小值為0µU/ml，最大值為17.9µU/ml，中位值為2.03µU/ml，平均值為2.43µU/ml，且90%、95%、97%、99%、99.5%、99.9%的百分位數分

17、別為5.07µU/ml、6.22µU/ml、7.02µU/ml、9.18µU/ml、10.59µU/ml、15.07µU/ml。參照99%百分位法并結合臨床比對實驗，自制試劑盒的篩查切值定在9.5µU/ml。表2 1690例正常新生兒足跟干血片用自制試劑盒測定的Neonatal TSH水平分布µU/mlNeonatal TSH含量µU/ml例數構成比%累計頻數累計頻率%0-37822.3737822.371-45727.0483549.412-35921.24119470.653-21812.901412

18、83.554-1036.09151589.645-814.79159694.446-432.54163996.987-181.07165798.058-150.89167298.939-60.36167899.2810-60.36168499.6411-20.12168699.7612-10.06168799.8213-00.0014-00.0015-20.12168999.9416-00.0017-10.061690100.0018-00.0019-00.0020-00.0021-00.00 臨床比對實驗 157例標本正常125例，陽性32例，同時采用自制試劑盒和DELFIA ®

19、Neonatal TSH試劑盒檢測,臨床特異性為100%，臨床靈敏度為100%，陰陽性符合率為100%，約登指數為1，回歸方程為Y=0.9523X-0.3159, r=0.9822。 室間質評 2006-2007年兩年間參加全國新生兒篩查檢驗室間質評，共6次30個樣本,經質評結果分析，實測值均在可接受范圍內靶值±30%。平均偏倚為3.79%-12.50%13.29%。3 討論 目前已用于新生兒篩查的有酶免分析法、放射免疫分析法、免疫放射法、TrFIA法、熒光酶免分析法和自動新生兒篩查系統等。20世紀80年代初，我國開始在北京、上海、天津、沈陽等8大城市開展了CH的篩查，調查發現我國C

20、H的發病率為162559。TrFIA法因靈敏度高、室間CV小，已被國內新篩實驗室應用并成為優選方法10，但國外試劑昂貴，檢測本錢高。自建的Neonatal hTSH TrFIA法靈敏度高可達2.28µU/ml，且在測量范圍內，自制試劑盒劑量-反響曲線的相關系數r 達0.9987，與hLH、hFSH、HCG無明顯交叉反響，分析內或分析間質控結果在靶值±25%內，分析內CV<15%，分析間CV<20%，與對照試劑標準品進行準確性比對實測值與標示效價比平均值為1.05，與對照試劑比對符合率一致，相關性系數r可達0.9822，試劑盒室間質評能力比對成績100%，在國內自制試劑盒TrFIA法率先獲得準字號國食藥監械準字2005第3401233號。自建的Neonatal TSH TrFIA微量檢測法能滿足臨床應用需要，具有