1、膜片鉗常見問題解答1 .什么是電壓鉗與膜片鉗，有什么區別？答：電壓鉗技術是通過向細胞內注射一定的電流，抵消離子通道開放時所產生的離子流，從而將細胞膜電位固定在某一數值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映離子流的大小和方向。膜片鉗技術鉗制的是膜片”，是指采用尖端經過處理的微電極與細胞膜發生緊密接觸，使尖端下的這片細胞膜在電學上與其它細胞膜分離，這大大降低了背景噪聲，使單通道微弱的電流得以分辨出來。采用電壓鉗技術將這片膜的電位鉗制在某一數值，可記錄到單通道電流。從這點上看，膜片鉗技術是特殊的電壓鉗技術。隨著膜片鉗技術的發展，它已經不僅僅局限于膜片”的概念，也不僅僅采用電

2、壓鉗技術，還常采用電流鉗技術。2 .離子通道電導的單位是什么？如何換算？答：離子通道電導的單位是西門子（Siemens,S）,舊稱姆歐，即安培/伏特。常用皮西門子（pS）,1pS=10E-12S,1,000pS=1pA/mV。3 .MultiClamp700A中，在放大器和信號器的連接中，放大器的rawoutput是否需要連接信號器的ANALOGIN接口？scaledoutputrawoutput有什么區別？答：Rawoutput為原始信號輸出，放大器輸出的信號沒有經過處理（如濾波、放大等），scaledoutput為定標輸出，輸出的信號經過了處理。后者的靈活度大，因此多采用。目前膜片鉗放大器

3、多設有scaledoutput,你可將其與數模轉換器（你所說的信號器）的ANALOGIN連接，這樣放大器的輸出信號就能傳送給計算機了，此時已經沒有必要再使用Rawoutput了。若你想記錄兩個輸出，則需要將Rawoutput與數模轉換器的另一個ANALOGIN連接。4 .在Clampex的Editprotocol/Wave中，Step和ramp各有什么適用范圍？答：Ramp多用于電流衰減緩慢的離子通道以及失敏不明顯的受體通道的I-V曲線制作，如多用于鉀、鈣離子通道。而像鈉通道，其衰減非常迅速，在持續去極化的情況下，通道很快失活，無法使用ramp,另外諸如煙堿受體通道等具有明顯失敏特征的受體通道

4、也不宜采用ramp。5 .什么是ramp?有什么作用？答：與步階（step）不同，ramp在pClamp軟件中表示施加給細胞的一種逐漸變化的電壓或電流，稱為斜坡電壓或電流”，可用于作通道I-V曲線。6 .inputresistance!什么意思？如何測量？答：在電生理學中，inputresistance指輸入膜電阻（Rin）全細胞記錄時，給細胞膜施加一系列刺激方波（一般為超極化），在離子通道沒有開放的情況下測定跨膜電流，根據歐姆定律即可求出Rin。膜電阻（Rm）與膜輸入阻抗Rin的關系為：Rm=4Tt2Rin,r為細胞半徑。7 .在一次電壓鉗全細胞記錄中，是否每次一定要做電容消除、用連電阻補償

5、、漏減、和液接電位矯正？答：在電壓鉗實驗中，如果需要給予細胞電刺激來改變細胞膜電位（如超極化或去極化），則會出現膜的被動反應，產生電容電流與電阻電流，此時，前者需要用電容補償消除，后者需要用漏減功能消除。全細胞記錄中，串聯電阻是必須要補償的（至少要補償80%）,除非它很小而忽略不計。液接電位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可采用Clampex軟件中白菜單Tools/JunctionPotential功能對其測算，然后決定是否需要校正。8 .Decay是什么意思？和inactivation有何區另？答：Decay是衰減”之意，inactivation是失活”之意，但在文獻中經常混

6、用，decay也常常被說成失活，例如鈣電流的衰減常被說成失活，這樣用也沒什么問題。但實際上，兩者細分的話還是有區別的。可以將Inactivation分為穩態失活與非穩態失活。后者即Decay,是指在刺激因素（電位變化、施加藥物等）持續存在下通道的失活，而穩態失活（Steady-stateinactivation一般是指將膜電位鉗制在不同的水平，然后觀察通道的失活情況，做出失活曲線。9 .什么是尾電流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？答：在離子通道的激活因素（去極化或超級化）結束時通道的關閉過程叫做去激活（Deactivation）,所記錄到的電流稱為尾電流（Tailcurrent）,主

7、要反映通道的關閉特征。延遲整流性K+離子通道以及一些不同類型的Ca2+離子通道，它們的尾電流均具有電壓依賴性，關閉過程呈指數分布，可用指數方程擬合而獲得通道關閉過程的時間常數。尾電流的分析對研究電壓門控性離子通道的激活、關閉、失活等動力學過程很有幫助。如研究尾電流幅度與脈沖電壓的關系、脈沖電壓的不同持續時間或尾電流不同的鉗制電壓對尾電流幅度、衰減時間常數的影響等等。通過這些研究可了解通道關閉過程中出現的不同關閉狀態。藥物可影響通道的關閉過程，表現為尾電流的衰減過程變快或變緩慢。10 .如何理解steadystateactivation的steadystate的意義？答：“steadftate是

8、穩態”的意思。一般通過給予細胞持續一定時間的一系列去極化（多為去極化）脈沖來激活離子通道，記錄通道電流峰值，再計算出電導G,作出G-V曲線，該曲線稱為穩態激活曲線，也就是我們常說的激活曲線。11 .電極拉制程序中具體應該如何控制。在參數設定的摸索中，是否需要每次都用顯微鏡檢測，還是另有更易操作的方法.答：不同的拉制儀拉制參數的設置不盡相同，你需要閱讀說明書，參數中主要是設定拉力（對于P-97拉制儀，只需要設置Velocity,可不用設定Pull）與溫度。一般第一步拉制電極頸部，溫度要比第二步高（對于P-97拉制儀，溫度的設定需要先測量Ramp值），拉力不要過大，以保證頸部較短；第二步拉制尖端，

9、一般要使溫度低些，拉力大些。一般都是通過顯微鏡查看電極尖端，這很簡單，并不復雜！最好是拋光，這樣就在拋光儀顯微鏡下查看。注意拋光后的電極尖端開口會變小，故在拉制電極時，尖端開口要大些。檢查電極還有其它方法，如氣泡數法”，也可用放大器通過測量電阻來查看。12 .Rm=4冗2Rin?似乎Rin是一個用細胞大小標化的膜電阻，那為什么不用電容Cm來標化而用這個什么4冗r2細胞形X各異，Cm是個公認的膜面積的指標，電流密度不就是用Cm標化的嗎？盼回答，同時希望能將Rin的意義再多講一點，謝謝答：（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin這兩個符號，文獻中常混用，但實際上表示的大多是Rin。通常我們所說的膜電

10、阻”是指膜輸入阻抗Rin”，但也有人用來指Rm。（2）你可以用Cm來計算膜面積，實際上這也正是我們的做法，用來估算細胞大小，用于對通道電流幅度進行標化，但我們從來不用它計算膜電阻Rm（也稱為固有膜電阻”）。Rm的計算公式是數學理論上的，并沒有多少應用的價值，我們很少發現有使用Rm的（雖然符號用Rm）。（3）實際上，Rin反映的當然就是膜電阻，它被稱為膜輸入阻抗（或膜輸入電阻），也時常被稱為膜電阻”（這正是使人們產生混淆的原因！），是膜的被動反應參數之一。所謂被動反應是指膜上離子通道沒有開放時，膜所表現出的電纜特性。膜的被動反應參數還包括膜電容、軸漿電阻等。全細胞記錄時，給細胞膜施加一系列刺激方

11、波（多為超極化），在離子通道沒有開放的情況下測定跨膜電流，根據歐姆定律可求出Rin。當大量離子通道開放時，膜對電流的阻力急劇降低，測試脈沖電壓與通道電流之間不滿足歐姆定律，無法測量Rin,也沒有了測量的意義。13 .請教什么是Channelavailability?答：Channelavailability指在排除失活情況下，能夠開放的某通道的多少，通過全細胞電流幅度的大小來反映。例如，海馬神經元Na通道的channelavailability可因乙酰膽堿M受體的激活而降低，表現為Na通道電流幅度的降低。14 .什么是windowcurrent,我知道是激活曲線和失活曲線的重疊。但是我有一個疑

12、問，比如電壓依賴的T型鈣通道，書上說在windonwcurrent的時候有持續性的鈣內流，但是T性鈣通道不是有時間依賴性的失活嗎？怎么會有不失活的電流呢？答：如果將通道的穩態激活曲線與失活曲線作在一個圖上，則激活曲線與失活曲線之間交叉部分的電流就是windowcurrent,在這個電壓范圍內，有一些通道并沒有完全失活，仍能被打開，有一定的開放概率。T性鈣通道是有時間依賴性的失活，但還有很小的部分失活非常緩慢，此即windowcurrent,它是一些快速失活通道的動力學特征。對于T型鈣通道，其windowcurrent維持了一個緊張性去極化，對動作電位的連續發放產生影響，當然，不同細胞中的T通道

13、其作用不盡相同。15 .使用Clampex8.0記錄配體門控離子通道電流，protocol如何設置？答：需要事先在LabBench中設定好Channel序號和Signal名稱。在EditProtocol中選擇Gap-free模式，采樣頻率可用5kHz,選好Input和Output。先在Clampex中啟動記錄（Record）,然后誘發電流，可用TimeTag作誘發標記。16 .電極內液中加入1mmol/L的EGTA和10mmol/L的EGTA有什么區別？答：EGTA一般用10mM左右（1mM太低），促進封接，鰲和內鈣。17 .什么是漏電流，為什么要做Leaksubtraction?答：漏電流的

14、概念比較混亂，可以指封接電流（封接時從封接處漏掉”的電流），也可指放大器的系統偏差，還可指膜漏電流。一般來講，膜漏電流是細胞膜的被動反應電流，是非離子通道電流，因此在記錄離子通道電流時要將它去除。膜片鉗放大器與采樣分析軟件都具有將其去除的漏減功能。18 .請問動作電位是否一定要有越過0的超射，我在一篇文獻中看到作者將一個沒有超射的電位變化也稱為動作電位，我覺得不對，應該是閾下反應才對吧？但又不敢下結論，覺得國外文獻不該出錯。答：一般生理情況下動作電位都含有超射，超射與Na離子（或Ca離子）的平衡電位有關。但在具體實驗中（或某些病理情況下），若細胞內外液的Na離子（或Ca離子）的濃度發生變化，則

15、Na離子（或Ca離子）的平衡電位也隨之變化，就可能不產生超射或超射值更大19 .我想請教一下為什么我們用培養的大鼠海馬神經元記錄NMDA電流，總是會出現電流的衰減，而且我們記錄是選擇的培養第10-14天的大鼠，可是電流大小不等，具體在100-1500PA間波動，這讓我們很疑惑，注明一下，電極內液中我們用了CsCl和ATP、GTP。答：電流大小不等與細胞大小、細胞狀態等都有關，另外更重要的可能與你的給藥方法有關，不知你采用的是哪種給藥方法？正常情況下，連續誘發受體電流會存在失敏，表現為電流的衰減（幅度減小），但如果在記錄過程中細胞狀態逐漸不好，也會出現這種情況。我們認為你所選用的細胞培齡沒有問題，內液也沒問題。20 .腦片實驗中，ACSF的配方中的