1、12培養(yǎng)細胞的觀察檢測方法生物技術教研室生物技術教研室 李延蘭李延蘭3w 活細胞的觀察檢測方法活細胞的觀察檢測方法w 培養(yǎng)細胞常用的染色方法培養(yǎng)細胞常用的染色方法w 細胞生長狀況有關指標的檢測方法細胞生長狀況有關指標的檢測方法w 細胞生物活性的有關化學檢測方法細胞生物活性的有關化學檢測方法w 電子顯微鏡技術電子顯微鏡技術4 一、活細胞的觀察檢測方法一、活細胞的觀察檢測方法w 肉眼觀察肉眼觀察w 相差顯微鏡觀察相差顯微鏡觀察 細胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天觀察，以便及時細胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天觀察，以便及時了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細胞形態(tài)、細胞有了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細胞形態(tài)、細胞有

2、無移動、有無污染、培養(yǎng)液無移動、有無污染、培養(yǎng)液pHpH是否變酸、變黃、是是否變酸、變黃、是否更換等。否更換等。 細胞常規(guī)檢查的方法為：細胞常規(guī)檢查的方法為：56肉眼觀察肉眼觀察 一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察，主要看培養(yǎng)一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察，主要看培養(yǎng)液的液的顏色顏色和和透明度透明度的變化。的變化。pH pH 顏色顏色 透明度透明度 正常正常 7.27.27.4 7.4 桃紅色桃紅色 清亮、透明清亮、透明酸性產(chǎn)物酸性產(chǎn)物 變淺、變黃變淺、變黃 污染污染 混濁混濁變黃變黃 pH pH pHpH 變紅變紅7w大多數(shù)細胞適于在大多數(shù)細胞適于在pH 7.2pH 7.27.47.4條件下生長，低于條

3、件下生長，低于pH 6.8pH 6.8或高于或高于pH 7.6pH 7.6對細胞有害，甚至造成細胞退化或死亡。細對細胞有害，甚至造成細胞退化或死亡。細胞對堿性不如對酸性的變化耐受，胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細胞生長有利境對細胞生長有利。w 隨細胞數(shù)量的增多、代謝加強，釋放隨細胞數(shù)量的增多、代謝加強，釋放COCO2 2增多，使增多，使pH pH 降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH pH ，多在培養(yǎng)基中加入磷，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。酸鹽等緩沖劑。w羥乙基哌嗪乙硫磺酸（羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HepesHepes）：對細胞無

4、毒性，也不起：對細胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止緩沖作用，主要作用是防止pHpH迅速變動，在開瓶通氣培迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的pHpH值。值。w若培養(yǎng)瓶、瓶塞漏氣，若培養(yǎng)瓶、瓶塞漏氣， 使使COCO2 2溢出，或者由于洗刷不潔、溢出，或者由于洗刷不潔、殘留堿性物，殘留堿性物，使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅，致使細胞難以生長，甚，致使細胞難以生長，甚至死亡。至死亡。8玻璃器材玻璃器材w 常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管。培養(yǎng)皿、吸管、離心管。w 首次使用：

5、首次使用：w 重復使用的處理步驟：重復使用的處理步驟：自來水刷洗自來水刷洗0.1稀鹽酸浸泡過夜稀鹽酸浸泡過夜自來水沖洗自來水沖洗自來水刷洗自來水刷洗硫酸重鉻酸鉀浸泡過夜硫酸重鉻酸鉀浸泡過夜自來水沖洗自來水沖洗10次次雙蒸水沖洗雙蒸水沖洗2次次單蒸水沖洗單蒸水沖洗3次次晾干、包裝晾干、包裝121高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌20min9顯微鏡觀察顯微鏡觀察 相差顯微鏡相差顯微鏡 （phase contrast microscopephase contrast microscope） 活細胞對光線是透明的，光線通活細胞對光線是透明的，光線通過活細胞時，波長和振幅幾乎沒有過活細胞時，波長和振幅幾乎沒有改變

6、，所以用普通光鏡無法看清未改變，所以用普通光鏡無法看清未經(jīng)染色的活細胞。經(jīng)染色的活細胞。 2020世紀世紀3030年代年代 荷蘭荷蘭 ZernikeZernike 原理：原理：利用光的衍射和干涉特性，利用光的衍射和干涉特性，把透過標本不同區(qū)域的光波的光程把透過標本不同區(qū)域的光波的光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細胞內(nèi)各種結(jié)差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比，構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比，從而使標本的各種結(jié)構(gòu)變得清晰。從而使標本的各種結(jié)構(gòu)變得清晰。 10相差顯微鏡觀察活細胞的步驟如下：相差顯微鏡觀察活細胞的步驟如下： 1112w生長良好的細胞，在顯微鏡下可觀察到生長良好的細胞，在顯

7、微鏡下可觀察到細胞透明度細胞透明度大，折光性強，輪廓不清大，折光性強，輪廓不清。w若細胞生長狀態(tài)不良，可見若細胞生長狀態(tài)不良，可見細胞輪廓增強，細胞折細胞輪廓增強，細胞折光性變?nèi)酰毎|(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒光性變?nèi)酰毎|(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細胞之間空隙增大，細胞形態(tài)不規(guī)則，甚狀物質(zhì)，細胞之間空隙增大，細胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細胞的特點，產(chǎn)生圓縮脫落，有時細胞至失去原有細胞的特點，產(chǎn)生圓縮脫落，有時細胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。細胞的生長狀態(tài)細胞的生長狀態(tài)13BMSCs14培養(yǎng)細胞的生長過程培養(yǎng)細胞的生長過程15w各種細胞及各代細胞增殖的時間不盡

8、相同。各種細胞及各代細胞增殖的時間不盡相同。w原代細胞、成體組織的潛伏期較長原代細胞、成體組織的潛伏期較長，24h24h后僅見到后僅見到部分細胞開始貼壁，部分細胞開始貼壁，9 912d12d長滿瓶底，細胞融合呈長滿瓶底，細胞融合呈交叉重疊生長。交叉重疊生長。w傳代細胞系、胚胎組織或幼體細胞潛伏期短傳代細胞系、胚胎組織或幼體細胞潛伏期短，一般，一般經(jīng)過懸浮、貼壁伸展很快進入潛伏期、對數(shù)生長期，經(jīng)過懸浮、貼壁伸展很快進入潛伏期、對數(shù)生長期，細胞大量繁殖，逐漸相連成片而長滿瓶底。細胞大量繁殖，逐漸相連成片而長滿瓶底。w一旦發(fā)現(xiàn)細胞長滿瓶底一旦發(fā)現(xiàn)細胞長滿瓶底8080就應及時傳代，否則會就應及時傳代，

9、否則會影響細胞生長甚至脫落。影響細胞生長甚至脫落。w懸浮細胞懸浮細胞當發(fā)現(xiàn)生長顯著、密度增大、分布稠密、當發(fā)現(xiàn)生長顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)液變黃時也應及時傳代。培養(yǎng)液變黃時也應及時傳代。16Anip97317注意事項注意事項w標準化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或皿一般成像效果都較好，但標準化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或皿一般成像效果都較好，但反復刷洗過的玻璃或塑料器皿將嚴重影響分辨力。反復刷洗過的玻璃或塑料器皿將嚴重影響分辨力。w準備觀察的瓶、皿要平坦，質(zhì)地均勻，透光度好，在觀察前準備觀察的瓶、皿要平坦，質(zhì)地均勻，透光度好，在觀察前將培養(yǎng)瓶、皿面擦凈。將培養(yǎng)瓶、皿面擦凈。w天氣較冷時，由于溫差使培養(yǎng)瓶

10、內(nèi)壁形成霧滴而影響觀察的天氣較冷時，由于溫差使培養(yǎng)瓶內(nèi)壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，可輕輕將瓶傾斜使瓶內(nèi)培養(yǎng)液浸潤內(nèi)壁，以得到好清晰度，可輕輕將瓶傾斜使瓶內(nèi)培養(yǎng)液浸潤內(nèi)壁，以得到好的相差像。的相差像。w對原代細胞培養(yǎng)進行相差顯微照相，應在換液后進行，這樣對原代細胞培養(yǎng)進行相差顯微照相，應在換液后進行，這樣可以去除漂浮的組織塊和死細胞，提高成像清晰度?？梢匀コ〉慕M織塊和死細胞，提高成像清晰度。w觀察細胞時要有無菌概念，動作要輕，避免猛烈震蕩；觀察觀察細胞時要有無菌概念，動作要輕，避免猛烈震蕩；觀察時間不要太長，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影響細胞生長。時間不要太長，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影

11、響細胞生長。1819 活細胞的觀察檢測方法活細胞的觀察檢測方法w 暗視野顯微鏡技術觀察活細胞暗視野顯微鏡技術觀察活細胞w 縮時顯微鏡攝影觀察縮時顯微鏡攝影觀察w 體外活細胞染色觀察體外活細胞染色觀察20暗視野顯微鏡技術觀察活細胞暗視野顯微鏡技術觀察活細胞（dark field microscope)原理：原理：利用特殊聚光器使光線不能進入物鏡，經(jīng)過標本的散射光線利用特殊聚光器使光線不能進入物鏡，經(jīng)過標本的散射光線使物鏡被放大，因此在黑暗背景中可呈現(xiàn)明亮的像。使物鏡被放大，因此在黑暗背景中可呈現(xiàn)明亮的像。優(yōu)點：優(yōu)點：反差增大，分辨率提高，可觀察到反差增大，分辨率提高，可觀察到5nm的微小質(zhì)點。的

12、微小質(zhì)點。應用：應用：觀察活細胞內(nèi)的細胞核、線粒體、細菌和霉菌等。觀察活細胞內(nèi)的細胞核、線粒體、細菌和霉菌等?？s時顯微攝影術觀察縮時顯微攝影術觀察（time-lapse cinemicrophotagraphy，TLCM）優(yōu)點：優(yōu)點：可直接記錄活細胞的連續(xù)動態(tài)變化過程，能非常直觀地展現(xiàn)可直接記錄活細胞的連續(xù)動態(tài)變化過程，能非常直觀地展現(xiàn)細胞生長過程中的動態(tài)變化，如細胞運動、細胞分裂、細胞膜變細胞生長過程中的動態(tài)變化，如細胞運動、細胞分裂、細胞膜變化、細胞死亡等過程。化、細胞死亡等過程。缺點：缺點：較昂貴較昂貴21體外活細胞染色觀察體外活細胞染色觀察 體外活細胞染色就是在體外培養(yǎng)條件下，用某體外

13、活細胞染色就是在體外培養(yǎng)條件下，用某種染料對活細胞進行染色，而不影響活細胞生命活種染料對活細胞進行染色，而不影響活細胞生命活動的一種方法。利用這種方法，可以對培養(yǎng)物進行動的一種方法。利用這種方法，可以對培養(yǎng)物進行染色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進行培養(yǎng)。染色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進行培養(yǎng)。堿性染料堿性染料酸性染料（酸性染料（臺盼藍臺盼藍、剛果紅、吡咯藍）、剛果紅、吡咯藍）活體染料活體染料噻嗪類（次甲基藍、甲苯胺藍）噻嗪類（次甲基藍、甲苯胺藍）惡嗪類（亮焦油藍、亮焦油紫）惡嗪類（亮焦油藍、亮焦油紫）丫嗪類（丫嗪類（中性紅中性紅、詹納斯綠）、詹納斯綠）三酚苯甲烷類（甲基紫、維克多利亞藍）

14、三酚苯甲烷類（甲基紫、維克多利亞藍）22w中性紅染色中性紅染色 常用活體染料，一般濃度為常用活體染料，一般濃度為1 1：1000010000，用生理鹽，用生理鹽水（或水（或HanksHanks液）溶解后進行高壓蒸汽滅菌暗處存液）溶解后進行高壓蒸汽滅菌暗處存放，可直接浸染放，可直接浸染活體細胞活體細胞顯微鏡下觀察或用于細胞顯微鏡下觀察或用于細胞的病毒蝕斑，肉眼計數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大，染的病毒蝕斑，肉眼計數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大，染色后細胞不能再培養(yǎng)。色后細胞不能再培養(yǎng)。w結(jié)晶紫染色結(jié)晶紫染色 使用濃度為使用濃度為0.10.1，可用生理鹽水配制，室溫保可用生理鹽水配制，室溫保存。該染料對存。該染料

15、對死、活細胞死、活細胞均著色，故只能測出細胞均著色，故只能測出細胞總數(shù)。總數(shù)。w臺盼藍染色臺盼藍染色 用用0.50.5濃度的臺盼藍（濃度的臺盼藍（trypan blue)trypan blue)，用，用PBSPBS配配制，室溫保存，該染料只對制，室溫保存，該染料只對死細胞死細胞著色，可測定活著色，可測定活細胞數(shù)和計算存活百分率。細胞數(shù)和計算存活百分率。23E. coli E. coli 以結(jié)晶紫以結(jié)晶紫 (crystal violet) (crystal violet) 染色染色24B.cereusB.cereus以石炭酸復紅以石炭酸復紅 (carbol fuchsin) (carbol fu

16、chsin) 染色染色25aureus aureus 以甲烯藍以甲烯藍 (methylene blue) (methylene blue) 染色染色26二、培養(yǎng)細胞常用的染色方法二、培養(yǎng)細胞常用的染色方法w 細胞固定的基本方法細胞固定的基本方法w 細胞常用的染色方法細胞常用的染色方法w 細胞特殊的染色方法細胞特殊的染色方法271、細胞固定的基本方法、細胞固定的基本方法w固定組織、細胞的目的：固定組織、細胞的目的： 把組織和細胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下把組織和細胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來，避免組織和細胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形來，避免組織和細胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等；同時，固定

17、還可以使細胞的各部分易于著色，等；同時，固定還可以使細胞的各部分易于著色，適于觀察、長期保存和分析。適于觀察、長期保存和分析。w固定組織、細胞的原則：固定組織、細胞的原則： 盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測工具、對象、盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測工具、對象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。目的和要求選擇固定劑和固定方法。28w固定前的準備：固定前的準備： 各種細胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培各種細胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。料。 懸浮細胞：懸浮細胞：離心（離心（8001000r/min）P

18、BS/Hanks漂洗漂洗23次次 貼壁細胞：貼壁細胞：用鑷子輕輕取出蓋片用鑷子輕輕取出蓋片PBS/Hanks漂洗漂洗23次次注：漂洗的目的是去除血清和附著于細胞表面的殘渣，注：漂洗的目的是去除血清和附著于細胞表面的殘渣，防止其妨礙染色。防止其妨礙染色。2930常用固定液常用固定液簡單固定液：簡單固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸等重鉻酸鉀、鋨酸等混合固定液：混合固定液：甲醇甲醇/ /醋酸固定液、醋酸固定液、FAAFAA固定液、固定液、CarnoyCarnoy固定固定液、液、BouinBouin固定液、固定液、4 4多聚甲醛多聚

19、甲醛-PBS-PBS固定液等固定液等甲醇甲醇/ /醋酸固定液：醋酸固定液：甲醇：冰醋酸為甲醇：冰醋酸為3 3：1 1，現(xiàn)用現(xiàn)配，現(xiàn)用現(xiàn)配，適用于適用于GiemsaGiemsa染色染色。FAAFAA固定液：固定液：90mL 8090mL 80酒精酒精5mL 5mL 冰乙酸冰乙酸5mL 405mL 40甲醛，甲醛，適用于蓋片單層培養(yǎng)的細胞，固定效果好。適用于蓋片單層培養(yǎng)的細胞，固定效果好。CarnoyCarnoy固定液：固定液：較好的非水溶性固定液，較好的非水溶性固定液，60mL 60mL 純酒精純酒精30mL 30mL 氯仿氯仿10mL 10mL 冰乙酸，適用于顯示細胞化學成分。冰乙酸，適用于顯

20、示細胞化學成分。312 2、細胞常用的染色方法、細胞常用的染色方法wH.EH.E（蘇木精（蘇木精- -伊紅）染色法伊紅）染色法原理：原理：堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細胞核和細堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細胞核和細胞質(zhì)發(fā)生反應，使細胞的微細結(jié)構(gòu)通過顏色而改變它的胞質(zhì)發(fā)生反應，使細胞的微細結(jié)構(gòu)通過顏色而改變它的折射率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細胞的圖像，并折射率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細胞的圖像，并能提供良好的核漿對比染色。能提供良好的核漿對比染色。染液配制：染液配制：染色步驟：染色步驟：染色結(jié)果：染色結(jié)果：細胞核染成紅色，細胞質(zhì)染成藍色。細胞核染成紅色，細胞質(zhì)染成藍色。323

21、3Giemsa（吉姆薩）染色法母液配制：母液配制： GiemsaGiemsa粉粉0.5g0.5g，甘油，甘油22mL22mL，將，將GiemsaGiemsa粉置于研缽粉置于研缽內(nèi)先用少量甘油與之充分混合，研磨至無顆粒；然后將剩余內(nèi)先用少量甘油與之充分混合，研磨至無顆粒；然后將剩余甘油混在一起，甘油混在一起，5656保溫保溫2h2h后，加入后，加入33mL33mL純甲醇，混勻，純甲醇，混勻，即為即為GiemsaGiemsa母液，保存于棕色瓶內(nèi)。母液，保存于棕色瓶內(nèi)。染液配制：染液配制：取取9 9份份pH6.87.38pH6.87.38的的SorensenSorensen緩沖液和緩沖液和1 1份份

22、GiemsaGiemsa母液混合即可。母液混合即可。染色步驟：染色步驟：細胞標本用甲醇細胞標本用甲醇/ /醋酸固定液固定醋酸固定液固定30min30min后，用滴管后，用滴管把染液布滿玻片上，染色把染液布滿玻片上，染色1015min1015min，用自來水沖去多余染，用自來水沖去多余染液，空氣干燥，二甲苯同名，光學樹脂封固。液，空氣干燥，二甲苯同名，光學樹脂封固。染色結(jié)果：染色結(jié)果：細胞核染成紅色，細胞質(zhì)染成藍色。細胞核染成紅色，細胞質(zhì)染成藍色。注意事項：注意事項：染液宜現(xiàn)配現(xiàn)用，保存時間最好不用超過染液宜現(xiàn)配現(xiàn)用，保存時間最好不用超過48h48h，GiemsaGiemsa對對pHpH極敏感，

23、緩沖液極敏感，緩沖液pHpH要調(diào)準確。要調(diào)準確。3435363、細胞特殊的染色方法、細胞特殊的染色方法w Feulgen Feulgen染色法染色法w CoomassieCoomassie染色法染色法w PASPAS反應法反應法w 油紅油紅OO（oil red Ooil red O）法）法w 免疫熒光染色法免疫熒光染色法w 免疫酶染色法免疫酶染色法37FeulgenFeulgen（福爾根）染色法（福爾根）染色法k 原理：原理：在在6060條件下，條件下，DNADNA分子中的嘌呤堿和脫氧核糖分子中的嘌呤堿和脫氧核糖的連鍵可被的連鍵可被1mol/L 1mol/L 鹽酸水解打開，游離出的脫氧核糖醛基

24、鹽酸水解打開，游離出的脫氧核糖醛基能與希夫（能與希夫（SchiffSchiff）試劑結(jié)合，形成紫紅色復合物。在此過）試劑結(jié)合，形成紫紅色復合物。在此過程中，程中，RNARNA不受影響，故染色具不受影響，故染色具DNADNA特異性。準確的溫度特異性。準確的溫度和鹽酸濃度，適宜的水溫、時間是成功的關鍵。水溫過度和鹽酸濃度，適宜的水溫、時間是成功的關鍵。水溫過度或不足均降低染色強度?；虿蛔憔档腿旧珡姸?。 此法能對此法能對DNA DNA 進行特異性染色進行特異性染色k 試劑配制：試劑配制： 1mol/L HCL1mol/L HCL：濃：濃HCL 8.5ml HCL 8.5ml 蒸餾水蒸餾水 91.5

25、ml91.5ml Schiff Schiff試劑：母液裝入棕色瓶，蓋緊，黑紙包裹置于暗處試劑：母液裝入棕色瓶，蓋緊，黑紙包裹置于暗處k 染色過程：染色過程：選用選用CarnoyCarnoy固定液固定液k 染色結(jié)果：染色結(jié)果：細胞核染成粉紅色至紫紅色，胞質(zhì)為無色。細胞核染成粉紅色至紫紅色，胞質(zhì)為無色。3839考馬斯亮藍（考馬斯亮藍（CoomassieCoomassie，BBBB）染色法）染色法原理：原理：顯示細胞骨架、細胞內(nèi)微絲的染色方法顯示細胞骨架、細胞內(nèi)微絲的染色方法試劑配制：試劑配制：固定液：固定液：0.1mol/L NaH2PO42H2O 14.0mL0.1mol/L NaH2PO42H

26、2O 14.0mL 0.1mol/L 0.1mol/L Na2HPO412H2O 36.0mLNa2HPO412H2O 36.0mL蒸餾水蒸餾水50.9mL50.9mL2525戊二戊二醛醛50.0mL50.0mL染色液：甲醇染色液：甲醇46.5mL46.5mL冰醋酸冰醋酸7.0mL7.0mL考馬斯亮藍考馬斯亮藍0.02g0.02g染色過程：染色過程：染色結(jié)構(gòu)：染色結(jié)構(gòu)：細胞內(nèi)的微絲呈現(xiàn)藍色。細胞內(nèi)的微絲呈現(xiàn)藍色。4041過碘酸席夫反應法過碘酸席夫反應法（periodic acid Schiff reactionperiodic acid Schiff reaction，PASPAS） 原理：原

27、理：過碘酸是一種強氧化劑，能將葡萄糖的乙過碘酸是一種強氧化劑，能將葡萄糖的乙二醇基（二醇基（CHOH-CHOHCHOH-CHOH）氧化成兩個游離的醛基，）氧化成兩個游離的醛基，它們與它們與SchiffSchiff試劑反應生成紫紅色產(chǎn)物。試劑反應生成紫紅色產(chǎn)物。 細胞內(nèi)糖類的染色方法細胞內(nèi)糖類的染色方法 試劑配制：試劑配制： 染色過程：染色過程： 染色結(jié)果：染色結(jié)果：細胞含糖原區(qū)呈紫紅色。細胞含糖原區(qū)呈紫紅色。4243細胞內(nèi)脂類的染色方法細胞內(nèi)脂類的染色方法| 蘇丹（蘇丹（SudanSudan）/法法| 蘇丹黑法蘇丹黑法| LillieLillie油紅油紅OO（oil red Ooil red

28、O）法）法| CainCain硫酸尼羅藍（硫酸尼羅藍（NileNile）法）法| 鋨酸（鋨酸（osmic acidosmic acid）法）法444546油紅油紅OO（oil red Ooil red O）法）法w 優(yōu)點：優(yōu)點：油紅油紅OO染色的脂肪比蘇丹染色的脂肪比蘇丹法染的顏色要法染的顏色要深，對微小的脂滴易于顯示，而且沉淀較少。深，對微小的脂滴易于顯示，而且沉淀較少。w 1010中性甲醛溶液的配制中性甲醛溶液的配制pH 7.0pH 7.0：量取量取37374040甲醛甲醛20mL20mL，蒸餾水，蒸餾水180mL180mL，加入，加入0.8g 0.8g 磷酸磷酸二氫鈉二氫鈉NaHNaH2

29、 2POPO4 4HH2 2OO、1.3g 1.3g 磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉NaNa2 2HPOHPO4 4，配制成，配制成200mL 10200mL 10中性甲醛溶液，中性甲醛溶液，密封備用。密封備用。4748w 免疫熒光染色法免疫熒光染色法w 原理：將已知抗體或抗原標記熒光素，用此特異性試劑，原理：將已知抗體或抗原標記熒光素，用此特異性試劑，浸染含有相應抗原或抗體的組織細胞標本，借助抗原抗體的浸染含有相應抗原或抗體的組織細胞標本，借助抗原抗體的特異性結(jié)合，于抗原或抗體的存在部位呈現(xiàn)熒光，從而可以特異性結(jié)合，于抗原或抗體的存在部位呈現(xiàn)熒光，從而可以定位標本內(nèi)的抗原或抗體。定位標本內(nèi)的抗原或抗體

30、。w 免疫酶染色法免疫酶染色法w 原理：原理：ABCABC免疫酶染色法即卵白素免疫酶染色法即卵白素- -生物素生物素- -酶復合物法，酶復合物法，是目前最敏感的免疫細胞化學染色法之一。其基本原理是將是目前最敏感的免疫細胞化學染色法之一。其基本原理是將特異性第一抗體與組織細胞相應抗原結(jié)合后，通過生物素化特異性第一抗體與組織細胞相應抗原結(jié)合后，通過生物素化橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助卵白素與生物素的天然親和性橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助卵白素與生物素的天然親和性將生物素化辣根過氧化酶連接為復合物，通過酶促反應，顯將生物素化辣根過氧化酶連接為復合物，通過酶促反應，顯示組織細胞相應的抗原。示組織細胞相應的

31、抗原。4950三、細胞生長狀況有關指標的檢測方法三、細胞生長狀況有關指標的檢測方法w 細胞計數(shù)法細胞計數(shù)法w 細胞生長曲線細胞生長曲線w 細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù)w 克隆形成率克隆形成率511、細胞計數(shù)法、細胞計數(shù)法 細胞計數(shù)法是用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中的細胞計數(shù)法是用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)目，以測定細胞增殖和調(diào)整細胞濃度。細胞數(shù)目，以測定細胞增殖和調(diào)整細胞濃度。 臺盼藍染色法用于檢測存活細胞數(shù)。臺盼藍染色法用于檢測存活細胞數(shù)。 注：臺盼藍染色注：臺盼藍染色排除檢測法，排除檢測法，由于死細胞的細由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，染料可大量進入?yún)s不能被排胞膜通透性發(fā)生改變，染料可

32、大量進入?yún)s不能被排出，因而細胞被染色；而活細胞能排出細胞內(nèi)的染出，因而細胞被染色；而活細胞能排出細胞內(nèi)的染料，因而不易著色。料，因而不易著色。52Trypan blue staining of adult rat cardiac myocytes in primary culture. Live cells exclude the blue dye, and so appear clear. Dead cells take up the dye and appear blue.535455結(jié)果分析結(jié)果分析w細胞密度細胞密度 細胞數(shù)細胞數(shù)/ml/ml（4 4大格細胞數(shù)之和大格細胞數(shù)之和/ 4 /

33、 4 ）10104 4稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)w細胞存活百分率細胞存活百分率 細胞活力（）未著色細胞數(shù)細胞活力（）未著色細胞數(shù)總細胞數(shù)總細胞數(shù)100100562 2、細胞生長曲線、細胞生長曲線w細胞生長曲線是細胞培養(yǎng)實驗中最基本的指標，是細胞生長曲線是細胞培養(yǎng)實驗中最基本的指標，是觀察同一代細胞的增殖過程。根據(jù)細胞生長曲線分觀察同一代細胞的增殖過程。根據(jù)細胞生長曲線分析細胞增殖析細胞增殖w方法一：方法一：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔一代細胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24h24h取出幾瓶細胞進行計取出幾瓶細胞進行計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標，不同時刻的細

34、胞數(shù)為縱數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標，不同時刻的細胞數(shù)為縱坐標，即為該細胞的生長曲線。坐標，即為該細胞的生長曲線。w方法二：方法二：四氮唑鹽（四氮唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法573 3、細胞分裂指數(shù)、細胞分裂指數(shù)w細胞分裂指數(shù)是表示細胞增殖旺盛程度的指標；以被測1000個細胞中的分裂細胞數(shù)來計算。w方法：染色后血細胞計數(shù)板計數(shù) 細胞分裂指數(shù)細胞分裂相數(shù)/細胞總數(shù)（1000）100584、克隆形成率、克隆形成率w克隆形成率所計數(shù)的細胞必為貼壁和有增殖能力的克隆形成率所計數(shù)的細胞必為貼壁和有增殖能力的細胞，反映細胞群體依賴性和增殖能力。細胞，反映細胞群體依賴性和增殖能力。w各種細胞克隆形成率差別很

35、大，一般初代細胞克隆各種細胞克隆形成率差別很大，一般初代細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤弱，轉(zhuǎn)化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。細胞強。w方法方法 克隆形成率克隆數(shù)克隆形成率克隆數(shù)/接種細胞數(shù)接種細胞數(shù)100w注意：細胞要分散好，不能有細胞團，接種密度不注意：細胞要分散好，不能有細胞團，接種密度不要過大。要過大。5960 四、細胞生物活性的化學檢測法四、細胞生物活性的化學檢測法w 四氮唑鹽（四氮唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法w 細胞蛋白質(zhì)含量測定法細胞蛋白質(zhì)含量測定法w

36、細胞蛋白質(zhì)合成的細胞蛋白質(zhì)合成的3 3H-H-亮氨酸摻入試驗亮氨酸摻入試驗w 細胞細胞DNADNA合成的合成的3 3H-TdRH-TdR摻入試驗摻入試驗611 1、四氮唑鹽（、四氮唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法w原理：原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTTMTT黃黃色溶液色溶液還原成不溶性的還原成不溶性的藍紫色結(jié)晶物藍紫色結(jié)晶物，并沉積于細，并沉積于細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSODMSO）和酸化的異丙醇或酸化的和酸化的異丙醇或酸化的SDSSDS等均能溶解細胞中的等均能溶解細胞中的紫藍色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀，在紫