1、    六種細胞凋亡檢測方法的比較        細胞凋亡已成為生物醫學領域的研究熱點。隨著研究的日益深入,細胞凋亡的檢測技術日漸成熟和完善,如形態學檢查、DNA降解分析和流式細胞分析(FCA)等1。我以地塞米松(DEX)誘導淋巴瘤Raji細胞凋亡,利用6種不同方法檢測細胞凋亡,并比較其結果，對這些方法加以評價。一、材料與方法1.材料：（1）細胞系：Burkitt淋巴瘤細胞株(Raji，澳大利亞墨爾本大學醫學院Austin醫院血液科提供),常規培養于10%熱滅活小牛血清的RP

2、MI 1640液中。實驗用細胞均處于指數生長期。（2） 主要試劑：DNA未端定量(TdT)法和放射自顯影法的試劑分別由Pharmacia和Bresatec公司提供；FCA試劑購置于Bender Med System公司，原位缺口末端標記(TUNEL)法試劑來自Boehring Mannheim公司；其它化學試劑由Sigma公司提供。2.方法：（1）細胞凋亡的誘導培養2：5 ml Raji細胞(1×107個/ml)與1.0 mol/L DEX培養2、4、8和16小時后,分別收集細胞,作細胞凋亡的檢測。對照組不加DEX培養16小時。（2）DNA抽提和凝膠電泳3： Raji細胞的DNA抽提

3、按標準的酚-氯仿-異戊醇抽提法進行。通過測定DNA溶液在260 nm和280 nm的吸光度確定DNA的量與純度。凝膠電泳時取約1 g DNA樣品，在TBE緩沖液，1%瓊脂糖凝膠上，5.0 V/cm電泳3小時，溴化乙錠(EB)染色,在紫外發光儀下觀察并照相。（3）透射電鏡（EM）觀察:培養細胞離心,以PBS液洗2次后，用2.5%的戊二醛于4 冰箱固定30分鐘，常規制作電鏡標本,雙鉛染色后,置1200EX型透射電鏡(JEOL公司)觀察。（4）TdT法和放射自顯影法：采用已建立的TdT法4和利用同一標記反應進行的放射自顯影法5分析DNA梯形帶。（5）TUNEL6：培養細胞離心以新鮮配制的4%多聚甲醛

4、PBS液(pH7.4)室溫下固定30分鐘,然后用Boebringer Mannbeim公司提供的試劑盒進行檢測。標記產物在光鏡下顯棕色。（6）FCA7：培養細胞以0.1 mmol/L PBS液(pH7.4)洗2次，懸溶于190 l結合緩沖液中,調整細胞濃度為1×106個/ml。加10 l異硫氰酸熒光素(FTIC)標記的連接素(Annexin)和10 l的20 mg/L的普匹碘氨(PI),混勻,避光室溫孵育10分鐘。用結合緩沖液洗1次后用Coulter Elite 流式細胞儀 (Coulter公司)進行分析。二、結果1.DEX誘導的Raji細胞凋亡：透射電鏡與DNA梯形帶分析是目前鑒定

5、細胞凋亡最具特征性的指標1，8。電鏡觀察結果顯示，經DEX誘導8小時的Raji細胞有典型的凋亡細胞出現。其特征是細胞核體積縮小,染色質濃縮致密,并沿核膜分布形成新月體狀,細胞膜微絨毛消失,但細胞漿內的各種細胞器基本正常(1)。未經DEX誘導的細胞8小時培養后仍未見典型的凋亡細胞出現。瓊脂糖凝膠電泳和放射自顯影分析結果（2）表明，經DEX誘導的Raji細胞DNA呈現典型的梯形帶,但放射自顯影較瓊脂糖凝膠電泳至少敏感50倍以上,因在同樣條件下檢測DNA梯形帶,前者僅需DNA 5 ng,而后者卻至少需250 ng。同時,TUNEL結果顯示DEX誘導細胞與對照細胞相比,細胞核內有明顯的標記產物出現。根

6、據電鏡與TUNEL的形態學識別標準1，6，9，由2位有經驗的觀察者以雙盲法分別記數500個細胞,結果顯示凋亡細胞數隨DEX誘導時間延長而增加(2，表1)。 1DEX誘導組的Raji細胞，凋亡細胞()×2 000M：分子量標志，1：DNA-50 ng，2：DNA-250 ng，3：DNA-1250 ng(左)，DNA-500 ng、DNA-50 ng、DNA-5 ng(右)；4：對照組DNA2DEX誘導組瓊脂糖凝膠電泳和放射自顯影分析的結果2.FCA定量凋亡細胞：對15 00020 000細胞進行FCA定量分析并區分活細胞(連接素V陰性/普匹碘氨陰性),凋亡細胞(連接素V陽性/普匹碘氨

7、陰性),繼發性壞死細胞(連接素V陽性/普匹碘氨陽性),機械性損傷細胞(連接素V陰性/普匹碘氨陽性)。FCA結果顯示,凋亡細胞數與DEX孵育時間呈顯著的正相關(r>0.95)(3，表1)。3三種凋亡細胞方法檢測結果的比較表1四種檢測細胞凋亡方法結果比較(%)時間組（h）電鏡凋亡細胞TUNEL陽性細胞FCA 連接素-V陽性細胞TdT次/(min.g)DNA)0(0.5)(0.8)(2.0)3 9402(0.6)(2.3)(4.3)180 9004(2.3)(4.5)(6.5)266 8008(7.5)(11.2)(9.8)469 05016(16.7)(18.9)(13.2)701 2363

8、.TdT法定量DNA降解末端：TdT法分析DEX誘導Raji細胞凋亡的動力學試驗結果表明, DNA末端標記量與DEX濃度大小和作用時間長短呈顯著正相關(r>0.98，4);經1.0 mol/L DEX作用不同時間(2、4、8、16小時)的Raji細胞產生的DNA末端標記量較對照組高約45、68、119和178倍,與其他方法相比,顯示TdT法具有高檢測靈敏度(表1)。 4TdT法定量DNA末端標記量結果4.4種細胞凋亡方法的比較：以線性回歸對4種細胞凋亡方法（電鏡、TUNEL、FCA和TdT法）的結果分析表明，DEX誘導的凋亡細胞數或DNA降解末端標記量與DEX作用時間具有顯著的相關性(r

9、>0.98)。用電鏡作為檢測凋亡細胞的金標準1，10，與其他3種方法(TUNEL、FCA、TdT)比較,結果發現它們之間有顯著相關性(r0.98)。把TdT法與FCA的結果比較發現,二者仍有良好的相關性(r=0.99)。三、討論通過對6種檢測細胞凋亡的方法進行比較發現,既簡單又特異的方法仍是經典的透射電鏡形態學觀察和凝膠電泳檢測DNA梯形帶,但其缺乏檢測的靈敏度,而且難以定量；應用末端標記結合放射自顯影可使DNA梯形帶的分析較凝膠電泳檢測的靈敏度提高至少50倍;4種定量細胞凋亡的方法（透射電鏡、TUNEL、FCA、TdT法）的檢測結果之間有較好的相關性。同時, FCA快速、準確，適用于單

10、個或培養細胞(如血液,骨髓)的檢測,而TdT法的檢測靈敏度很高,如與檢測特異性強的方法結合,可使分析效果更佳。值得提出的是,依賴形態學的透射電鏡或TUNEL法定量凋亡細胞費時效率較低,重復性較差8，9。本文6種檢測細胞凋亡的方法的檢測特點和原理不盡相同。有4種方法是分析凋亡細胞核酸內切酶的激活引起的DNA降解,它們分別是檢測DNA梯形帶的凝膠電脈和放射自顯影,標記細胞內降解DNA產生的3-OH末端(TUNEL),定量DNA末端的標記量(TdT法),但后兩種方法的特異性不強是因其他形式的死亡細胞,如壞死細胞也可以引起TUNEL和TdT法的陽性結果11。本文的FCA陽性結果是基于凋亡細胞膜上磷脂對

11、稱性的改變,而使磷脂酰絲氨酸外露,進而與連接素V特異結合,同時用PI分析細胞膜的完整性以定量檢測早期的凋亡細胞和晚期的壞死細胞數,結果客觀、快速、重復性好。通過對6種檢測細胞凋亡方法的比較研究發現,目前尚無完美的檢測手段,眾多研究方法各具特點,也有其局限性,故在研究細胞凋亡時,需結合既特異、靈敏,又能定量的多種檢測手段,檢測細胞在凋亡發生過程中的不同事件,提供更加準確、客觀、全面的實驗依據。志謝:本課題在澳大利亞墨爾本大學醫學院Austin醫院血液科、病理科完成。本課題受國家自然科學基金資助(編號39870296)作者單位：610041 成都，華西醫科大學附屬第一醫院醫學檢驗專業，檢驗科參考文

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