1、細菌對四環素類抗生素的耐藥機制：四環素類藥物為廣譜抗生素，發現于20世紀40年代，是通過阻止氨酰tRNA與核糖體結合位點（A）的結合來阻止菌體蛋白合成的一類抗生素，具有廣泛的抗菌活性。在臨床中以其有效的殺菌作用及較小的副作用而被廣泛用于治療人和動物的細菌性感染。此外，在包括美國在內的一些國家，四環素還被大量用作生長促進劑投喂給動物。近年來耐藥性的出現限制了它們的使用。在20世紀50年代中期以前，主要的共生菌和病原菌都對四環素敏感，例如,19171954年分離到的433株不同的腸桿菌僅2%對四環素耐藥。而L1ma等的研究表明,1988-1993年間60%的S.f1exneri分離株對四環素、鏈霉

2、素和氯霉素耐藥。1 .四環素類抗生素家族20世紀40年代發現了四環素家族的首批成員金霉素（chlortetracycline，氯四環素）和土霉素（oxytetracyc1ine，氧四環素）,隨后又相繼發現其他四環素類藥物，其中有些為天然分子，如四環素（tetracycline）；有些為半化學合成產品，如美他環素（methacycline，甲烯土霉素卜多西環素（doxycycline）和美滿霉素（minocyc1ine,米諾環素）等。隨著研究的不斷深入，水溶性好或口服吸收率高的新型半合成藥物如羅利環素（rolitetracycline）和賴甲環素（lymecycline）相繼問世；最新研制出的甘

3、氨酰環素已完成I期臨床試驗，目前正在進行H期臨床試驗。而一些早期的藥物，如氯莫環素（clomocycline卜羅利環素、賴甲環素和金霉素在各國都已不再使用。2 .四環素類抗生素的作用機理四環素類藥物具有抗菌活性的最重要特征是每種藥物的分子中都包括一個線性熔合的四環素核。結構最簡單的具有抗菌活性的四環素分子是6-脫氧-6-去甲基四環素，此結構被認為是最小的藥效基團。四環素類抗生素通過阻止氨酰tRNA與細菌核糖體結合來抑制細菌蛋白質合成，四環素分子必須通過一個或多個膜系統（革蘭氏陽性菌和陰性菌各自具有不同的膜系統）才能與它們的靶位結合，從而達到有效的殺菌作用。因此，在探討四環素作用方式時需考慮到跨

4、膜吸收和核糖體結合這兩種機制。四環素穿越革蘭氏陰性腸道菌外膜是以被動轉運陽離子（可能是Mg2+）-四環素復合物的形式經OmpF、OmpC孔蛋白通道，并在道南（D。nnan）電位作用下穿過外膜進入細胞在胞外質中積累。在胞外質中四環素分子被分解釋放，并通過擴散作用穿過內膜（細胞質膜）的脂質雙層最終進入細胞內。四環素類藥物穿越革蘭氏陽性菌細胞質膜的方式則是形成電中性親脂分子，是能量依賴性的，并由細胞內外的H+濃度差所驅動。在細胞質中H+和二價陽離子濃度都高于細胞外，所以細胞質內的四環素分子可能被螯合，形成Mg2+-四環素復合物與核糖體結合。3 .四環素類抗生素耐藥的分子機制1980年Mender等第

5、1次研究腸桿菌科和假單胞菌質粒的四環素耐藥決定子的基因機制，到現在已經明確了29個不同的tet基因和3個otr基因淇中18種tet基因和1種otr基因編碼外輸泵,7種tet基因和1種otr基因即。t(A)編碼核糖體保護蛋白，1種tet基因即tet(X)編碼一種修飾或鈍化四環素的酶，但tet(X)基因的功能在天然宿主中并不能起作用。3.1 夕卜輸泵蛋白(Effluxprotein)在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中都有外輸泵基因，而且大部分外輸泵基因都具有四環素抗性。四環素外輸泵蛋白屬于主要異化超家族(MFS),是目前Tet蛋白中研究最清楚的。所有tet外輸泵基因都編碼膜相關蛋白可將四環素泵出胞外，

6、降低了細胞內藥物濃度保護了胞內的核糖體，從而產生耐藥性。每個tet外輸泵基因都編碼約46ku膜結合外輸泵蛋白，這些蛋白依據氨基酸的同源性可分為6個群:第1群蛋白包才§Tet(A卜Tet(B/Tet(C)、Tet(D)、Tet(E)、Tet(G)、Tet(H)、Tet(Z)，還可能有Tet(I)、Tet(J)和丁et(30)3該群蛋白具有12個跨膜口-螺旋，其四環素抗性蛋白具有41%78%的氨基酸同源性，而它們的四環素阻抑蛋白具有37%88%的氨基酸同源性。該群蛋白的基因大部分只存在于革蘭氏陰性菌中，只有tet(Z)存在于革蘭氏陽性菌中。許多外輸泵蛋白存在于雙分子脂膜中，以親水氨基酸環

7、凸出到周質和細胞質空間，外輸泵蛋白逆濃度梯度將四環素-陽離子復合物泵出胞外。革蘭氏陰性菌外輸泵基因分布廣泛，通常與大質粒相連，且大多為結合性質粒。這些外輸泵基因大都來源于不同的不相容質粒群5,這些質粒通常也攜帶其他抗性基因(如抗金屬基因)和病原因子基因(如毒素基因)。因此，介導任何一種抗性因子就是傳遞攜帶多重抗性的質粒，這一交叉選擇的現象可能是細菌多重耐藥現象日趨嚴重的重要原因之一。第2群蛋白包括Tet(K)和Tet(L)。該群蛋白具有14個跨膜口-螺旋，它們具有58%59%的氨基酸同源性。這些蛋白主要存在于革蘭氏陽性菌中。tet(K)和tet(L)基因主要存在于小的傳遞性質粒中，它們偶爾會整

8、合入葡萄球菌染色體、枯草桿菌染色體或金黃色葡萄球菌的大質粒中。葡萄球菌的大質粒攜帶tet(K)相對不常見,而小質粒攜帶tet(K)基因則較普遍。小質粒代表了一族密切相關的質粒，其大小為4.44.7kb。pT181質粒是這一族的代表，已測出全序。pT181還可攜帶除tet(K)外的其他抗藥基因。少數質粒攜帶的tet(L)已被測序,相互之間具有98%99%的同源性。較為特殊的是枯草桿菌染色體上的tet(L),該基因與其他tet(L)基因序列僅有87%的同源性。第3群蛋白包括Otr(B)和丁cr3,發現于鏈霉菌屬，這些蛋白與第2群蛋白的拓撲結構相似，具14個跨膜口-螺旋。第4群蛋白包括TetA(P)

9、,分離于梭菌屬，具有12個跨膜口-螺旋。第5群蛋白包括從恥垢分支桿菌分離到的Tet(V)。第6群蛋白包括從紋帶棒狀桿菌分離到的未命名的蛋白，其被認為是利用ATP而不是質子泵作為能源的。3.2 核糖體保護蛋白(Ribosomalprotectionproteins)已知9種核糖體保護蛋白，這些存在于細胞質中的蛋白具有保護核糖體免受四環素作用，使細菌具有抵抗多西環素和美滿霉素的能力，且耐藥譜比攜帶不含tet(B)外輸泵基因的細菌廣泛。有資料說明核糖體保護蛋白與核糖體結合可引起核糖體構型的改變，使四環素不能與其結合，但并不改變或阻止蛋白的合成。GTP水解可提供核糖體構型變化所需的能量。核糖體保護蛋白

10、與延伸因子EF-Tu和EF-G有同源性，它們與核糖體的結合是競爭性的。核糖體保護蛋白和EF-G在核糖體上有重疊的結合位點，核糖體保護蛋白需從核糖體上游離下來使EF-G與核糖體結合6,7。Tet(M)和Tet(O)蛋白是研究得最多的核糖體保護蛋白，它們具有核糖體依賴的GTP水解酶活性。無論是Tet(M)還是Tet(O)蛋白，當有GTP而不是GDP存在時就會使四環素與核糖體的結合能力減弱3,8。盡管在這一群中只有兩個蛋白被廣泛研究，但其他核糖體保護蛋白Tet(S)、Tet(T)、Tet(Q)、TetB(P)、Tet(W)和Otr(A)的氨基酸序列與Tet(M)和Tet(O)具有相似性，因此也可能具

11、有GTP水解酶活性，以同樣的方式與四環素和核糖體相互作用。核糖體保護蛋白可根據氨基酸的同源性分類。第一類包括Tet(M)、Tet(O)、Tet(S)和新發現的Tet(W)蛋白,第二類包括Otr(A)和TetB(P)蛋白，第三類包括Tet(Q)和丁et(T)蛋白。3.3 滅活或鈍化四環素的酶(Enzymaticinactivationoftetracycline)tet(X)基因是唯一通過產生滅活四環素的酶而耐藥的。已報道兩株厭氧擬桿菌轉座子上攜帶有tet(X)基因。tet(X)產生44ku胞蛋白，它在氧和NADPH存在時可化學修飾四環素，序列分析表明這個酶與其他NADPH需要的氧化還原酶有同源

12、性。3.4 其他(未知)耐藥機制(Othe/Zunknowmechanismsofresistance)Tet(U)蛋白有低水平的耐四環素能力。其基因編碼的11.8ku蛋白包括105個氨基酸，比外輸泵蛋白(45ku)和核糖體保護蛋白(72ku)小。鏈霉菌。tr(C)基因序列尚未見報道推測。tr(C)基因并不編碼外輸泵和核糖體保護蛋白，但otr(C)是否與tet(X)類似編碼鈍化酶，或與tet(U)類似具有一種新的耐藥機制尚不明確。4四環素類抗生素耐藥基因的發生率病原菌或條件致病菌(Pathogenicandopportunisticorganisms)病原菌或條件致病菌中的大部分tet基因與轉

13、移質粒、轉座子、結合轉座子相連，這些轉移單位可使tet基因在種間傳遞或通過結合在更大范圍的屬間傳遞10。最初在腸桿菌科和假單胞菌中發現的革蘭氏陰性菌tet基因現也在奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、密螺旋體和弧菌屬中相繼發現。tet(B)基因在革蘭氏陰性菌tet基因中具有最為廣泛的宿主，現已在20種革蘭氏陰性菌屬中被檢測到11。然而，tet(M)已在26個革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中檢測到。一些基因如tet(E)的宿主范圍可能較為有限，因為它們定位于不可轉移的質粒上，由此減少了向其他種屬轉移的機會。一些種屬中的tet基因僅表現較低的耐藥水平，不能保護存在于臨床和環境四環素濃度下的細菌。革蘭氏陽性菌也可獲得

14、四環素抗性質粒，特別是在多重耐藥中更為普遍。1994年的研究資料顯示，大約90%耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、70%無乳鏈千菌、70%多藥耐藥糞腸球菌都具四環素抗性。“革蘭氏陰性菌tet基因”是指那些只在革蘭氏陰性菌中被發現的基因。這些基因的G+C含量(>40%)高于來源于革蘭氏陽性菌的基因。所有革蘭氏陰性菌基因都編碼外輸泵蛋白，但如果轉入革蘭氏陽性菌宿主中則不能高效表達。很多革蘭氏陰性菌tet基因受阻抑子調控,與結構基因轉錄方向相反。“革蘭氏陽性菌tet基因”通常是指發現于革蘭氏陽性菌中，具有相對較低的G+C含量(W35%)的基因，但目前在越來越多的革蘭氏陰性菌中發現具有該基因，尤以tet

15、(M)基因最為突出，現已從臨床分離的8種革蘭氏陰性菌、18種革蘭氏陽性菌中被檢出。此外,實驗室中可將tet(M)基因轉入更多的菌屬中12。嚴格胞內寄生的病原體如衣原體和立克次氏體還未獲得四環素抗性，因為這些病原體存在于細胞內，只有細胞同時被兩種病原體感染才可能發生基因交換。但突變導致的耐藥性上升則更可能發生在這些胞內寄生的病原體中13。共生菌(Commensalmicroorganisms)共生菌與機會致病菌及病原菌具有相同的tet基因、質粒、轉座子和結合性轉座子，如肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌及許多口腔草綠色鏈球菌都可獲得的tet(M)、tet(O)、tet(L)和tet(K)基因。此外，在長期藥

16、物壓力選擇下，革蘭氏陽性菌具有從攜帶一個tet基因轉為攜帶多重tet基因的趨勢。在個別革蘭氏陽性菌中可找到不同種類的多重tet基因盒，如分枝桿菌和鏈球菌，但在革蘭氏陰性菌中特別是腸道菌中則不常見14。總之，已經發現很多致病性的革蘭氏陰性菌屬攜帶的四環素抗性基因與同屬的共生菌相同。革蘭氏陰性菌如嗜血桿菌、奈瑟氏菌和擬桿菌，革蘭氏陽性菌屬如鏈球菌都攜帶與條件致病菌相同的tet基因。因此，共生菌具有作為病原菌tet基因或其他抗性基因儲藏庫的作用，并有助于說明細菌菌群保持和傳播抗生素抗性基因的機理。5tet基因的分布和轉移tet基因廣泛存在于從人、動物和環境中分離的細菌中，大多數tet基因都與結合或移

17、動元素相連，這可以部分解釋為什么它們在細菌中能廣泛分布。革蘭氏陰性菌中tet外輸泵基因發現于轉座子，并可插入到不同的不相容質粒中。革蘭氏陽性菌外輸泵基因與小質粒相連,核糖體保護蛋白基因tet(5)和1佇1(。)可以存在于結合質粒或染色體上在染色體上它們不能自己移動。tet(M)和tet(Q)基因主要與結合染色體元素相連，并編碼它們自己的轉移。這些結合轉座子轉移可將質粒移動到其他菌屬中5。革蘭氏陰性細菌目前39個革蘭氏陰性菌屬、23個革蘭氏陽性菌屬及相關菌屬的耐四環素機制已經被闡明。其他尚未明確的tet基因可能存在，因為已檢測出不攜帶現有tet基因的四環素耐藥株。新的抗四環素基因不斷被發現，新的

18、菌屬也被檢出攜帶tet基因。tet(A卜tet(B)、tet(C)、tet(D卜tet(E)、tet(G卜tet(H)、tet(I卜tet(J)、tet(Y卜tet(30心口tet(31返因在革蘭氏陰性菌屬中廣泛存在，這些菌屬中大部分屬腸道菌群。tet(B)基因在革蘭氏陰性菌中最為廣泛，已在不同細菌中檢出，如放線共生放線桿菌、流感嗜血桿菌、莫拉桿菌和齒垢密螺旋體16。革蘭氏陰性菌中發現的tet基因的數量是不同的，既有攜帶一種tet基因，如tet(B)、tet(M)或tet(Q),也有發現于埃希氏菌屬中多達七條tet外輸泵基因。然而，已經發現大腸桿菌質粒攜帶不超過一種類型的tet基因。相反，鏈霉

19、菌屬和革蘭氏陽性菌屬個別分離株常攜帶多個基因，編碼相同的抗生素抗性，包括四環素抗性。tet(G卜tet(H)和tet(I)基因在革蘭氏陰性菌中很少檢出。科學家們仍在研究某些菌屬只攜帶一種tet基因，而另一些菌屬則可攜帶一系列不同的tet基因的原因。對革蘭氏陰性菌質粒不相容群的研究發現，它們決定其細菌宿主的范圍，質粒宿主的變化范圍非常嚴格，如嗜血桿菌攜帶的結合性大R-質粒，在本菌屬外其他宿主中就不能存在。這些質粒宿主范圍可能影響到與它們相連的部分tet基因的傳播5。目前,8種革蘭氏陰性菌屬攜帶tet(M)基因,7種攜帶tet(Q),5種攜帶tet(W),2種攜帶tet(0),2種攜帶tet(K),各有1種攜帶tet(H卜tet(I)、tet(J卜tet(Y)、tet(30)、tet(31)。根據它們較低G+C含量，tet(K)、tet(L)、tet(M)、tet(O卜tet(P)、te