1、文獻綜述誘導性多能干細胞的研究進展及其在再生醫學上的應用摘 要 ：通過特定轉錄因子的過表達使體細胞重編程為誘導性多能干細胞（ induced pluripotent stem cells ， iPS 細胞） ， 這一成果引起了整個生命科學領域的廣泛關注. 由于 iPS 細胞不僅具有與人類胚胎干細胞（embryonicstem cell ， ES 細胞） 相似的基本特征，而且與 ES 細胞相比，不存在免疫排斥和倫理道德問題，因此， 具有重要的臨床應用潛能. 目前， iPS 細胞主要用于細胞分化和移植，并可提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、 篩選新藥以及開發新的治療方法. 從 iPS

2、細胞的產生、誘導方法、生物學特征和在再生醫學中的應用作以研究！關鍵詞：誘導性多能干細胞；胚胎干細胞；重編程；再生醫學 正文1iPS 細胞的產生主要經歷了3 個大的階段. 1981 年，小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell ，ES 細胞） 建系干細胞是近30 年來生物學發展最快的領域（ Evans 和 Kaufman） ，這些具有全能性的細胞在體外可以誘導分化為不同類型的細胞，為組織修復開辟了新途徑. 盡管這些細胞來源于囊胚內細胞團，基本不存在去分化和重編程的問題， 但自誕生之日起，就一直深受倫理道德和異體排斥等問題的困擾. 隨著克隆羊“多利”的誕生，開創了體細胞在卵母細胞中去

3、分化和重編程的先河 . 2000年， Munsie 等從小鼠體細胞核移植囊胚中分離得到了小鼠ES 細胞，從而拉開了治療性克隆研究的序幕，使利用病人的健康體細胞對自身的病變組織進行修復成為了可能，盡管這一技術可以避免異體移植所造成的排斥反應，但仍然深陷倫理道德爭論的漩渦之中.2006 年， Yamanaka 等將 4 個轉錄因子導入已分化的小鼠皮膚成纖維細胞，進而獲得了類似于ES 細胞的多能性干細胞，即“誘導性多能干細胞”（ induced pluripotent stem cells ， iPS 細胞） . 2007 年， Yu 等和 Takahashi 等又分別采用相同的基因改造的方法將人的

4、體細胞逆轉為類ES細胞， 這些劃時代的成果不僅解決了利用干細胞進行組織修復所面臨的免疫排斥和倫理學問題，在利用病人正常細胞進行組織自我修復方面具有巨大的應用前景，而且是用來研究細胞去分化和基因組重編程的重要途徑（不需要胚胎或卵母細胞） . 這個具有里程碑意義的發現揭開了再生醫學領域的新篇章.2iPS 細胞的誘導方法迄今為止，短短幾年的時間內iPS 細胞的研究取得了突飛猛進的發展，僅誘導方式而言，從病毒方法如逆轉錄病毒、慢病毒和腺病毒，到非病毒的轉座子載體和蛋白質均能介導外源轉錄因子誘導產生iPS 細胞 . 利用逆轉錄病毒和慢病毒載體誘導生成iPS 細胞時，可能會引起外源基因整合到體細胞基因組，

5、引起插入突變， 如果將這些iPS 細胞應用于臨床治療，會存在安全隱患. 因此， Aoi 等利用不與宿主細胞整合的腺病毒、質粒為表達載體瞬時轉染靶細胞可以獲得iPS細胞，這對再生醫學領域的發展是一個重大進步，但是該方法極低的誘導效率限制了其在實際研究中的應用.隨后，部分研究小組嘗試利用 Cre/LoxP系統、 oriP/EBNA1載體及piggyBac轉座系統等，將外源基因整合到受體細胞中誘導 iPS細胞，然后再將外源基因從iPS細胞的基因組中切除，從而得到不含外源 基因整合的iPS細胞，該系統誘導產生iPS細胞的效率明顯高于腺病毒和質粒 載體系統，達到0.1%1%.但是，驗證基因組不存在外源插

6、入基因的過程十分 繁瑣，且在基因剔除后，轉座酶識別位點有基因重排現象的發生.最近，Zhou等 利用融合了 4種轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的蛋白質直接誘導受體 細胞為iPS細胞.蛋白直接誘導iPS細胞在重編程過程中不會涉及任何的遺 傳修飾，且蛋白容易失活.從iPS細胞臨床應用的安全角度來看，它是目前最 安全的方法，但是需要進一步提高其誘導效率才有可能被廣泛應用.3iPS細胞的生物學特征ES細胞是全能干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，在體外可以無限增殖.iPS細胞類似于ES細胞，也具有多向分化潛能和發育的全能性， 可長期增殖培 養并保持高度未分化狀態.在正常培養體系中具

7、有穩定的二倍體核型，Yu等研究人和鼠iPS細胞核型時發現，只在極少數的細胞中出現畸形核，而大多數iPS 細胞核型正常.但Aasen等發現連續傳代培養人iPS細胞至第13代時畸形 核出現的幾率顯著增加，這與ES細胞的生長特性相似.通過RT-PCR和免疫組 化發現，iPS細胞也表達ES細胞特異的表面標志，如SSEA-1、SSEA-3SSEA-4 TRA1-60 TRA-1-81和TRA-2-49/6E 等；并且iPS 細胞具有向3個胚層分化 的潛能和自我更新能力.但是，許多研究也發現，iPS細胞并不等同于ES細胞. Takahashi等”通過對人類iPS細胞與ES細胞的32 266個轉錄產物的全序

8、 列基因表達圖譜進行分析發現，iPS細胞的1 267個轉錄產物基因（4%與ES 細胞存在5倍左右的差異.Niwa等“4研究也發現，iPS細胞中與多能性相關 的關鍵基因（Oct4、Sox2和Rex1）的表達水平比人類ES細胞系（HSF1和H9） 低兩倍.下面將從重編程過程中基因表達水平的變化、表觀遺傳學、發育潛能等方面分析iPS細胞的生物學特征.4iPS發育潛能特性細胞的表觀遺傳學含有的信息量極大，可能只通過表觀遺傳學就可鑒定iPS細胞.但是，要了解并選擇最嚴格的檢驗iPS細胞的指標，利用體內實驗分析重 編程過程、表觀遺傳學和發育潛能之間的相互作用有重要的意義.近期，Jaenisch和Young

9、詳細地對檢驗發育潛能的標準及其嚴格性進行了比較；對于iPS細胞最為嚴格的檢驗標準是通過四倍體補償法形成完全來源于iPS細胞的成活后代，而體外分化是最不嚴格的檢驗指標.但與ES細胞類似，由于倫 理道德等問題的限制，這些動物實驗只適于對小鼠等動物多能干細胞發育潛能的 測定，從而開始檢測人類iPS細胞發育潛能有效的方法只有體外分化和畸胎瘤 的形成.目前，檢測iPS細胞發育潛能較嚴格的方法主要是由iPS細胞生成嵌合體動物 和畸胎瘤試驗.迄今為止，采用四倍體補償法來檢測iPS細胞發育潛能的報道 很少.Wernig等采用四倍體補償法能使一些iPS細胞系（包括一個核型異常的 細胞系）發育到胚胎階段，但是其發

10、育程度卻不相同，有的能發育到中后期，有 的只能發育到胚胎前期，而一些有相似表達圖譜、沒有任何明顯缺陷的iPS細胞系卻一直未能生成四倍體胚胎. 至今為止，只有小鼠iPS 細胞通過與四倍體囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由iPS 細胞發育而來的小鼠，充分說明了iPS 細胞具有發育為完整個體的能力. 生成四倍體克隆動物效率低的原因可能與一些與重編程無關的原因有關，如： 病毒載體漏表達或小的基因片斷損傷 .5iPS 細胞在再生醫學的應用目前， iPS 細胞的生成不再必須通過向細胞基因組內導入外源病毒和基因來實現，其安全性得到了極大提高，并且全能性也得到了不斷的驗證. 同時， iPS 細胞由患者

11、自身體細胞誘導產生，可以避免倫理、免疫排斥等問題. 因此， iPS 細胞有更廣闊的應用前景，在再生醫學領域有巨大的應用潛力和優勢. 目前， 主要用于細胞分化和移植，并可提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發新的治療方法！如下圖：*screens細胞用于人類疾病的研究iPSTransplantation studies (ditsease in 56IMolj ral 1Cardiaccells4.1 在血液疾病方面的研究多項研究在人類血液疾病的小鼠模型中進行了iPS細胞應用的嘗試，并取得了初步成功.Hanna等在人源化的鐮刀型貧血病小鼠模型上獲取成纖維細胞，誘導建立了

12、iPS細胞系，然后通過同源重組的方法將病變基因修正，接著把遺傳修 飾后的iPS細胞定向分化為造血祖細胞，導入小鼠體內貧血癥狀明顯改善，這 是首次利用在動物疾病模型上的應用逐步開展.Xu等將由iPS細胞誘導分化的內皮前體細胞移植到患有血友病小鼠的肝臟中，使病鼠出血不止的癥狀得到了有效地改善.Raya等獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性iPS細胞，這些iPS細胞能夠分化形成表型正常的髓系和紅系的造血祖細胞.由此可見，iPS細胞對于治療一些血液疾病以及為罕見血型患者提供血細胞都具非常有重要的意 義.4.2 對神經系統疾病的研究iPS技術在治療神經系統疾病中顯示了很大的用途.Werning等對已建立的

13、小鼠iPS細胞進行體外誘導培養，可以將其誘導分化為神經前體細胞和多巴胺能 神經元，并移植到患有帕金森病小鼠體內能減輕其癥狀.最近一項研究利用帕金 森癥患者的皮膚細胞培育出了 iPS細胞，并能將其分化為多巴胺神經元細胞， 這是帕金森癥患者大腦中所缺少的一種重要細胞.因此，其有望成為治療帕金森 癥等神經系統疾病的一種方法.4.3 在心血管系統疾病的研究Narazaki等將原始iPS細胞誘導出中胚層細胞，并篩選出表達 F1k1 （內皮細 胞和血細胞最早的分化標志）的干細胞.之后誘導分化得到了淋巴管內皮細胞以 及心肌細胞，并發現由此分化而來的血管內皮細胞能形成類血管，表達幾乎所有心肌細胞標志物，如 N

14、kx2.5、a-MHC HCN4.由此證明，利用iPS細胞向心血 管分化的可行性，也進一步提示iPS細胞具有作為細胞移植治療心血管疾病中 種子細胞的潛力.Nelson 等將Oct4、Sox2、Klf4 與c-Myc轉入成纖維細胞， 使其誘導生成iPS細胞，接著再將iPS細胞定向分化為心肌細胞并移植入具有 完整免疫系統的成年小鼠梗死心臟內，能夠觀察到功能性的新生心肌.因此利用 iPS細胞有利于修復急性心肌梗塞等疾病.而Zhang等利用Oct4、Sox2、Nanog與 Lin28 產生的 iPS 細胞具有分化為心房、心室和竇房結細胞等的潛能，與 ES細胞在向心肌分化的潛能方面相似. 目前，雖然還沒

15、有iPS 細胞用于建造心血管疾病模型的報道，但是其應用于建立心血管疾病模型指日可待.4.4 糖尿病Keisuke Tateishi 等利用已建系的iPS 細胞成功地誘導分化出分泌胰島素的胰島細胞，并在無血清和正常培養條件下皆可成功地使iPS 細胞產生胰島素分泌細胞 . 證明 iPS 細胞具有分化成胰島細胞和胰腺內層的潛能，與ES 細胞相似.而Rene Maehr等通過對1型糖尿病患者的成體成纖維細胞重新編程（ Oct4， Sox2， Klf4 ） ，也可以得到iPS 細胞 . 最近研究顯示，將iPS 細胞誘導分化為胰島B細胞（其數量決定糖尿病患者殘存胰島細胞的衰退進程），并注入 1 型糖尿病和

16、2 型糖尿病小鼠體內，通過測定血糖及血紅蛋白A1c 水平顯示患病小鼠體內血糖濃度降低并且血糖波動性減輕. 這表明， iPS 技術可能是根治糖尿病非常有效的治療方式.4.5 對其他人類疾病的研究目前， iPS 細胞已廣泛應用于心血管疾病、血液系統疾病、中樞神經系統疾病等多種疾病的研究中，且已有多種遺傳病患者的特異性iPS 細胞系被建立. 同時，在不孕不育癥以及聽力、視力障礙等方面也進行了初步研究. Park 等將人源iPS 細胞經體外分化并分離得到原始生殖細胞（ PGC）s， 其與體內分離的PGCs 在基因表達上極為相似，如果能夠進一步將這些PGCs 分化為精子和卵子，就有望治療不孕不育癥. N

17、ishimura 等將患者自體產生的iPS 細胞經糾正后，再分化為耳蝸神經元并移植到小鼠體內，1 周后便可觀察到一些移植物開始表達谷氨酸標記的神經元. 這些結果表明，iPS 細胞可用來修復和移植受損的耳蝸神經. 最近一項研究表明，由逆轉錄病毒感染小鼠成纖維細胞產生的iPS 細胞可分化為視網膜前體細胞，并將其移植到經過免疫抑制處理的視網膜變性的小鼠身上，這些細胞形成了包含所有3 個胚層組織的畸胎瘤，其中也有神經視網膜. 由此可見， iPS 細胞可能是治療視網膜病變的一種手段.4.61 PS 細胞作為體外疾病模型目前， iPS 細胞可作為臨床藥物篩選細胞模型和人類疾病治療細胞模型. 例如，將來自患

18、者的iPS 細胞 肌萎縮側索硬化癥（ ALS） 分化成特定的細胞（運動神經元） 來研究改善疾病癥狀的藥物. 此外， Lee 等以罕見神經系統疾病患者的體細胞建立了iPS 細胞系，并解析了該種疾病的發病機制，以此來測試若干候選藥物的療效.目前， iPS 細胞廣泛地應用于對人類疾病的研究，并建立了多種疾病的動物模型，在不久的將來，有望成為治療人類疾病的一種手段. 然而，在iPS 細胞廣泛地應用于臨床之前，還有許多問題需要解決. 實際上，這些問題不只在iPS 細胞領域備受關注，在人類ES 細胞領域也很重視：1）需要進一步驗證是否有異源DNA引入到iPS細胞基因組中；2）生成人類ES細胞和iPS細胞的

19、效率很低；4.62 人類ES 細胞 / iPS 細胞能定向分化成一些特定的細胞，但是產生所有需要的特異細胞類型還要付出很大的努力；4）此外，一旦分化成特定的細胞系后需鑒定體外生成的細胞是否與體內相對應細胞相似，并如何純化細胞. 最近幾年，干細胞生物領域和iPS 細胞在臨床應用方面取得了巨大的進步，但是這里提出的問題可能仍要花數年時間才能被圓滿解決.5結 語iPS 細胞與再生醫學是目前研究的熱點，隨著 iPS 細胞基礎與臨床研究的深入，iPS 細胞必將開辟再生醫學領域的新紀元. 目前， iPS 細胞不僅為疾病治療和藥物篩選提供了理想的細胞模型，還可用于治療一些人類疾病，這是在再生醫學治療領域的有

20、益嘗試，但還遠未成熟，療效還缺乏長期的實踐，其作用機制也存在很多盲點. 這項技術真正用于疾病的治療還有相當長的路要走，如何高效獲得安全的人誘導性多能干細胞，如何定向誘導多能干細胞向某一特定類型的細胞分化并有效地將細胞移植入患者體內實現對疾病的治療等問題還需要進一步深入的研究 . 但其初步顯示出的臨床效果及安全性，使我們對未來的前景充滿期望，隨著人類對iPS 細胞不斷地深入研究，相信 iPS 細胞會成為各種疾病患者的新希望.參考文獻(References ) ：1 MUNSIE MJ , MICHALSKA E, O' BRIENCM et al. Isolation of plurip

21、otent embryonic stem cells from reprogrammed adult mousesomatic cell nucleiJ. Current Biology ，2 TAKAHASHIK ， YAMANAKAS. Induction of pluripotent stem cell frommouseembiyonic and adult fibroblast cultures by defined factorsJ. Cell.3 誘導性多能干細胞誘導效率和方法的研究進展張恩歡；胡智興；李瑪琳；4 再生醫學與誘導干細胞的關系李林娟；顧一凡；5 體細胞重編程為誘導性多能干細胞的研究進展王孟麗；沈曉麗；6 YU J， VODYANIKMA ， SMUGA-OTTKO， et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells J. Sc