1、【嘉美生物】即日起推岀WB, IH, ICC, IF實驗服務優惠活動，細則如下：1、嘉美生物提供原裝進口抗體。我實驗室進行實驗服務有若干年的歷史，因此我們實驗室存有大批的國外原裝抗體；意味著 實驗者不必要花更多的錢去購買國外昂貴(一般都會需要2000元以上)的一抗。2、嘉美生物免費提供二抗以及所有的與實驗相關的后續試劑。3、嘉美生物免費提供 WE標本所需要的蛋白保護液。該蛋白保護液可以保護樣品在4度下保存半個月而不至于蛋白有損失。4、實驗委托者之需要提供樣品，即可完成整個實驗。A Hippocampusj_JCortes匚冃E* *2dlinE 4 CocteKtlk陽KliniWB實驗服務案

2、例一抗目的蛋白分子量稀釋度公司/貨號二抗稀釋度Goat Rock1 antibodyAbout 160 kD1:500SANTA SC-6055Rabbit Anti GoatIgG/HRP1:40,000Goat Rock2 antibodyAbout 160 kD1:500SANTA SC-1851Rabbit Anti GoatIgG/HRP1:40,000Mouse GAPDH antibodyabout 37 kD1:800SANTA,SC-365062Goat Anti mouseIgG/HRP1:80,000注：SDS-PAG凝膠濃度為12%陽性條帶以Gel pro4.0版凝膠光

3、密度分析軟件進行分析，測其IOD( integrated optical density )累積光密度參考值。Fig 1 :亠 GAP 葉1:34 警 總Lanes:Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Lane 6Rows(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)Rockl242.39337.97229.78233.16151.48205.53Rock2233.48219.11238.76191.61151.18203.66GAPDH160.18130.47141.06156.13147.77151.07樣本編號253828232624wB操作規程一.

4、設備和試劑1 .設備電泳F電源Mini-PROTEAN3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPacBasic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)電泳儀及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)電轉儀及附件Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930) NC膜PIERCE Catalog#8801

5、8 濾紙Whatma n, 3MM CHR2.試劑凝膠試劑(實驗室常備)試劑名稱廠家30%丙烯酰胺溶液SIGMATris-BaseSIGMA10%SDSSIGMA10%過硫酸銨SIGMATEMEDSIGMA Total protein Extractio nKit ，ProMab?美國，Cat. No : SJ-200501Renewable Buffer 膜再生液，ProMab?美國，Cat. No : SJ-200512天然膜蛋白抽提試劑盒 ProteoExtract? (M-PEK), MERC德國，Cat. No： 444810天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒 NucBuster TM P

6、rotein Exaction Kit，MERCK?德國，Cat. No : 71183-3Bradford蛋白濃度測定試劑盒，嘉美生物 ？中國，Cat. No : BRAKIT細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒，嘉美生物 ？中國，Cat. No : P1001 細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒，嘉美生物 ？中國，Cat. No : P1003 常用溶液及緩沖液A. 5瀏層膠所用溶液按總體積2.5ml :ddH2O 1.7ml30初烯酰胺溶液：0.42ml1.0mol/L Tris (PH=6.8): 0.315ml10%SDS 25ul10%S硫酸銨:25ulTEMED 3ulB 分離膠溶液配

7、方參考表10 m i1S- mi尢心 mis蛉 ml3也 mi40 mlSO ml6° i GtiHjO300 Aayfamdel.b MTns MCl Ifxa B> |g SDS 10%ilWB« temed8*» GdHjQ30° AayfarridaI 5 MTrs HC <pHB Si 10% SOS咋過班IS義 TEMEDI Or* GelHjO3£r Aayiwride1 5 M Tne; HCi X b .iqsosTtMED 怙3HjQ30" ACT/umdoI 5 M Tne H住 ipHe &

8、；i 10% SOSioflTEMEDHiO30% Act秋加泊悝I巾悄T呻HQ *勒10% SDS0也晦整tempo3 _u s 1 1& 2 _2 o o Un0 o 1 J733.Q Q9 o3 3 £5.7:ei>.:0.0040.0080.0t2oo ia oca0 02<1o 0BQ»4 4o,a自 K3CMQo.0.3J.32-.11 o o fi-4 2 2 0 0O.OC60.009Q.0120.01 b189 0 b 3-J.a 1 3 fl- 7 Q Q Q .4*2 3 5 5 53 32.0.Q1 94.01.73.313J.5

9、0050.10.050.10,皿Q.0Q45 590 8 I 15.5.H 口口98 民D.O.O.11 915 910013 310 0Q3203阿 2Q.016097 5 5 56.2Q.QQGB o 6 o o o12 0 o 5 3301 a- 7 o D o1,1£.3945.79.222.55.075mo12J1&j03C.0S5.07it28MJ盟751Q.Q噸ai010_205&030.405005015D.2SD.40500020.004G.oao0010 OW0血C. 電泳緩沖液，1L3g Tris-Base、14.4g甘氨酸、1g SDS加蒸餾水

10、至IL, pH應該在8.3左右。也可以制成10X的儲存液， 在室溫下長期保存。|D. 電泳轉移緩沖液,1L3g Tris-Base、14.4g甘氨酸、甲醇200ml,加蒸餾水至1L,也可以制成10X的儲存液，在濕溫下長期保 存。E. 5 X樣品緩沖液，10ml0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCl (Ph6.8 )、5ml 50%的甘油、2ml 10%的 SDS 0.5ml 2-巰基乙醇、1ml 1%溴酚藍，0.9ml的蒸餾水，可在4 'C保存數周，或在-20 'C保存數月。二抗稀釋液用 1%BSA-PB(含 0.05%TWEEN2)稀釋。常用 Secondary An

11、tibody :Rabbit Anti Goat IgG/HRP, 嘉美生物,SEH0103,(1:10,00040,000)Goat Anti Rabbit IgG/HRP (SCBT, Catalog# sc-2030,1:10,00040,000)Goat Anti Mouse lgG+A+M(H+L)/HRP, ZYMED, #62-64201(1:40,000100,000)Goat anti-rat IgG-HRP,SANTA, sc-2032(1:5 0001:10 000)二蛋白提取(根據樣品及檢測要求選取以下適當提取方法)A-1 .組織裂解提取總蛋白(采用 Total pro

12、tein Extraction Kit，ProMab, Cat. No : SJ-200501 )1) .用剪刀剪取約0.5mg組織，置于組織勻漿器中，加入 1ml總蛋白提取液，勻漿 5min20min直到組織 充分破碎，然后冰上放置1020min后，再勻漿5min20min,將勻漿液吸出放到1.5ml離心管中。2) .超聲3次，每次3s。3) . 9000rpm，離心10min,取適量上清置于新的 1.5ml離心管中4) . -20 C 凍存。A-2 .組織裂解提取膜蛋白(采用天然膜蛋白抽提試劑盒ProteoExtract ? (M-PEK) ,MERCKCat. No： 444810)1)

13、 確定緩沖液充分融解，且被旋渦器充分混合。在抽提過程中緩沖液1和2保持在冰上并和蛋白酶抑制劑混合。|2) 以下組織的處理應當盡快轉移到4 'C無菌器皿中，如結締組織，脂肪血管等，最理想的組織應當切成2到3mm的碎塊，然后轉入一個裝有2ml冰冷緩沖液的管中洗滌。3) 輕輕彈打試管幾次沖散血細胞和其它松散物質。4) .組織碎塊在100 x g 4 C條件下離心2分鐘，小心移去上清液且保證沒有沉淀丟失。5) 加入2毫升冰冷緩沖液洗滌，重復步驟3和4洗滌，在最后的洗滌步驟之后，小心完全地除去所有的緩沖液。6) .轉移適當量的細碎切塊(可能冰凍的)到一個預冷的勻漿器。(最好是一個玻璃或石英制品)

14、，向勻漿器中加入10ul蛋白酶抑制劑，并立即加入2毫升冷的緩沖液1萃取組織塊。7) 小心地勻漿組織碎塊，可以使用杵磨碎組織細塊直到它們成為冰冷的混合體(例如 牛的肝臟需要10下)，盡可能使碎塊看不見。需要的用杵磨的次數取決于組織的結構。如果需要提高效率，可以事先使用顯微鏡觀察其結構。目的是為了得到單個細胞，而非對組織進行支離破碎。8) 盡可能完全地轉移混合物到一支預冷的管中并在4C輕柔的搖動10分鐘。推薦使用旋轉式振動器可以避免細胞結團的形成。9) .在16,000 x g 和4 C 15 min條件下分離不能溶解的材料。10) 丟棄上清液(豐富的“可溶性”蛋白質，此蛋白溶液可用于內參檢測)或

15、使用吸移管轉移它到樣品管，無需干擾底層細胞。切記分離所有液體。如果需要應當保留成數份冰凍以便以后分析。11) .放入5ul蛋白酶抑制劑到勻漿器中充分混勻，并立即加入1毫升冰冷緩沖液2萃取細胞團，使用吸移管仔細地完全地重懸細胞團。在30分鐘4 C條件下輕柔的搖動。推薦一臺旋轉式振動器避免細胞團的形 成。12) .在16,000 x g 和4 C 15 min條件下 分離不能溶解的材料。13) 使用吸移管完全轉移上層清液 (包括豐富的膜相關蛋白質)到樣品管，無需吸入細胞殘渣。A-3 .組織裂解分離提取漿/核蛋白(采用天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒 NucBuster TMProtein Exacti

16、on Kit ，MERC，Cat. No : 71183-3)1) .使用前漿冷凍的 Protease Inhibitor Coctail Set 1溶于100ul滅菌水配成100 x體積，分裝凍存于-20 度(13 X 107 細胞用 1ul/100 x ) o2) 所有蛋白體提取過程應在冰面上操作，保持蛋白的穩定性。3) .取約120mg適量的凍存組織置于 EP管中，加入液氮使用 EP管研磨杵快速研磨成粉末。4) .將適量粉末轉移至預冷的1.5ml EP 管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。5) 高速漩渦振動15S，冰面孵育5min，再次高速漩渦振動 15S。6)

17、 . 4 C，16000g 離心 5min。7) 移除上清液(為胞漿蛋白成分，可用于內參檢測)，胞漿蛋白可以保存他用或者丟棄，再用500ul預冷的1 X PBS再洗一次去除多余的胞漿蛋白。8) 在絮狀沉淀中加入1ul 100 x Protease Inhibitor Coctail1ul 100mM DTT75ul NucBuster Exaction Reagent 29) 高速漩渦振動15S,冰面孵育5min,再次高速漩渦振動15S。10) . 4C, 16000g離心 5min。11) .將上清液(核蛋白)轉移至另一管，可立即使用或分裝保存于-70C。B-1 .細胞裂解提取總蛋白(采用

18、Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No： SJ-200501 )1) .細胞收集好，加入1ml總蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置1020minmin 后，再吹5min20min,將勻漿液吸出放到1.5ml離心管中。2) .超聲3次，每次3s。3) . 9000rpm,離心10min,取適量上清置于新的1.5ml離心管中。4) . -20C凍存。B-2.細胞裂解提取膜蛋白(采用天然膜蛋白抽提試劑盒 ProteoExtract? (M-PEK), MERCJKCat. No : 444810)1) .確定緩沖液充分融解，且被旋渦器充分混合。在抽提

19、過程中緩沖液1和2保 持在冰上并和蛋白酶抑制劑混合。2) .將細胞收集好轉入一個裝有2ml冰冷緩沖液的管中洗滌。3) .輕輕彈打試管幾次沖散血細胞和其它松散物質。4) .在100X g 4C條件下離心2分鐘，小心移去上清液且保證沒有沉淀丟失。5) .加入2毫升冰冷緩沖液洗滌，重復步驟3和4洗滌，在最后的洗滌步驟之后， 小心完全地除去所有的緩沖液。6) .向裝有洗滌好的細胞的管中加入10ul蛋白酶抑制劑，并立即加入2毫升冷 的緩沖液1萃取細胞。7) .小心地吹打細胞，盡可能使細胞看不見。8) .盡可能完全地轉移混合物到一支預冷的管中并在4 C輕柔的搖動10分鐘。推薦使用旋轉式振動器可以避免細胞結

20、團的形成。9) .在16,000 x g和4 C 15 min條件下分離不能溶解的材料。10) .丟棄上清液(豐富的“可溶性”蛋白質，此蛋白溶液 可用于內參檢測)或使用吸移管轉移它到樣品管，無需干擾底層細胞。切記分離所有液體。如果需要應當保留成數份冰凍以便以后分析。11) .放入5ul蛋白酶抑制劑到管中充分混勻，并立即加入 1毫升冰冷緩沖液2萃取細胞團.，使用吸移管仔細地完全地重懸細胞團。在 30分鐘 4 C條件下輕 柔的搖動。 推薦一臺旋轉式振動器避免細胞團的形成。12) .在16,000 x g和4C 15 min條件下 分離不能溶解的材料。13) .使用吸移管完全轉移上層清液(包括豐富的

21、膜相關蛋白質)到樣品管，無需 吸入細胞殘渣。B-3 .細胞裂解分離提取漿/核蛋白(采用天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒NucBuster TM Protein Exaction Kit , MERC,Cat. No : 71183-3)1) .使用前漿冷凍的 Protease Inhibitor Coctail Set 1溶于100ul滅菌水配成100 X體積，分裝凍存于-20度(13 X 107細胞用1ul/100 X)。2) .所有蛋白體提取過程應在冰面上操作，保持蛋白的穩定性。3) .將細胞收集好在EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。4) .將適量粉末轉移至預冷的 1.5ml

22、EP管中，加入150ul NucBuster Reage nt 1。5) .高速漩渦振動15S,冰面孵育5min,再次高速漩渦振動15S。6）. 4C, 16000g離心 5min。7）.移除上清液（為胞漿蛋白成分，可用于內參檢測），胞漿蛋白可以保存他用或 者丟棄，再用500ul預冷的1X PBS再洗一次去除多余的胞漿蛋白。8）.在絮狀沉淀中加入1ul 100X Protease Inhibitor Coctail1ul 100mM DTT75ul NucBuster Exact ion Reage nt 29）.高速漩渦振動15S,冰面孵育5min,再次高速漩渦振動15S。10) . 4C，

23、16000g離心 5min。11）.將上清液（核蛋白）轉移至另一管，可立即使用或分裝保存于-70C。線粒體蛋白提取見附錄1三. 蛋白濃度測定：由于采用內參照法校正，省略根據總蛋白濃度估算點樣法。四. SDS-PAG電泳1）.將抗原（組織/細胞裂解液）樣品體積：5X loading buffer體積=5: 1，混 勻，在100C加熱三分鐘以使蛋白質變性。2）.設計加樣順序，作好實驗記錄，按預定順序加樣。一般每個電泳道加樣最大 體積為25卩l,每個電泳道上樣的最低蛋白質量（每一條蛋白質條帶）：0.1（考 馬斯亮藍染色）-2ng （銀染色）,最高蛋白質量（蛋白質混合物）：20-40卩g。3）.把電泳

24、裝置與電源連接好，將電壓調至200V,電流應流向陽極，待溴酚藍遷移到分離膠底部0.5cm處，關閉電源。4）.從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用去離子水沖洗干凈。準備進行免疫印操作。五. 免疫印跡操作-轉膜1）.將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉移緩沖液的容器中，浸泡15-20min.。2）.帶上手套，裁剪好濾紙（Whatman,3MM CHR和電轉膜，濾紙和膜大小為 83mX 75mm盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉移緩沖 液中，驅除留于膜上的氣泡。3）.打開轉移盒并放置淺盤中，用轉移緩沖液將海綿墊完全浸透后將其放在轉移 盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的 Whatma n,3MMS紙。4

25、）.小心將凝膠放置于濾紙上，避免氣泡（用轉移緩沖液潤濕并戴手套以轉移緩 沖液潤濕膠面，小心將電轉膜放在膠面上，從凝膠的一邊開始輕輕放下可避免氣 泡，注意一定要戴手套或鑷子接觸膜）。5）.用去離子水清洗緩沖液槽，在緩沖液槽中放入攪拌子，將另一塊海綿用轉移 緩沖液浸透后放在凝膠-膜“三明治”上，關上轉移盒并插入轉移槽。6）.將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4C預冷的轉移緩沖液。7）.將整個裝置放在磁力攪拌器上并開始攪拌， 連接好轉移電極恒流300mA專移 70min。8）.電轉完畢后，將電轉膜置于5%勺脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37C2小時 或4°C過夜。六. 免疫檢測一抗與靶蛋白的結合1)

26、 .封閉的膜用PBST漂洗2-3次。2) .將加樣槽洗滌干凈，用蒸餾水潤洗，晾干，將膜用一次性手套覆蓋好，按標 記和實驗設計切下膜條(一般為 3mm寬左右)按順序置于加樣槽中，作好實驗 記錄，加入相應的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。3) .室溫下于搖床孵育2h或4°C過夜。4) .棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加 2-3 mIPBST,上搖床洗滌洗滌5-10min，換液，反復4次。酶標記二抗與一抗的結合1) .根據實驗需要和設計選擇合適的酶標二抗和稀釋濃度(用含 0.5%脫脂奶粉 的PBS稀釋)，每個加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h或4C過 夜，注意

27、保證膜的所有部分同溶液接觸。2) .棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加 2-3 mIPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min，換液，反復4次。七. 化學發光將膜風干，貼在玻璃紙上，加底物，做化學發光，得到膠片。將背景較高的底片 片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，觀察到理想的結果時，終止反應，用 水清洗以去除不需要的背景。八. 根據實驗要求可適當選擇 Werstern Bolt 膜再生顯色法(采用Renewable Buffer 膜再生液，ProMab Cat. No : SJ-200512)1) 在完成WB勺顯色或化學發光檢測后，將蛋白轉印膜置1X PBS中漂洗5分鐘。2) .棄去1X PBS加入適量的 WB!再生液，至少需把膜完全覆蓋。在搖床上漂 洗 45min。3) .棄W0g再生液，加入1X PBS在搖床上漂洗5min后，棄去1X PBS重復3 次洗滌步驟