1、尿液中exosome的提取和鑒定一、 exosome的提取（一） 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1. 試劑：Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去離子水耗材：超速離心管50mL，15mL2. 配制Isolation solution 50 mL1. 10 mM Triethanolamine（三乙醇胺）（MW 185.7） 0.093 g2. 250 mM Sucrose（蔗糖）（MW 342.3） 4.28 g3. 加去離子水 至 45 mL4. 1 M NaOH 調(diào)pH至7.6 220 L5. 加去離子水 至 50mL6. 加protease inhibitors day of isolation

2、 3. 3. 5×SDS-Laemmli for Western Blot 50 mL 1. SDS 3.75g2. Glycerol 15 mL3. 1 M Tris-HCl， pH 6.8 2.5 mL4. Bromophenol溴酚藍(lán) dab5. DTT 60 mg/mL6. 去離子水至 50 mL（二） 實(shí)驗(yàn)步驟(Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010)1. 將80凍存的尿液取出解凍，渦旋，分裝在50mL離心管中。2.從-20中取出Sigma P2714 蛋白酶抑制劑，加入5mL二次水混勻。3.每50mL尿液中加入625 L溶解后的

3、蛋白酶抑制劑（12.5 L/mL Urine）。4.于4，17000 × g 離心15 min。（新鮮尿液25離心） （超速離心機(jī)型號(hào)Hitachi CP 80MX）5.取上清液置于超速離心管中，裝3管，每管分裝8mL， 4 200 000 × g離心1 h。（同上新鮮尿液25）6.離心后棄上清，再取17000 × g上清各8mL分置3管中，同上述條件離心。7.棄上清，3管中各加50L isolation solution，渦旋混勻30 s，轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5 mL Eppendrof離心管中。8.加1 mL 200 mg/mL DTT 95孵育2 min。9. 將

4、上述溶液轉(zhuǎn)移至高速離心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 × g超高速離心10min。10.棄上清，加50 L isolation solution溶解沉淀物，在17 000 × g 離心15 min。取上清做1D SDS/PAGE.11. Bradford 法測(cè)蛋白總濃度。12.按1:4體積比加入5×SDS-Laemmli 緩沖液（含60 mg/mL DTT），渦旋混勻。13.60加熱10 min，-80保存。（for western blot）朱墨桃?guī)熃闾崛xosome方法(Zhu, Li et al. 2012)1.2,

5、000 g for 10 min at 4 °C ，除去死細(xì)胞；2.取上清，4 °C 10,000 g 離心30 min，除去細(xì)胞碎片；3.取上清，4 °C 110,000 g離心70 min，棄上清；4.PBS清洗并重新分散，-80 °C保存。5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)測(cè)定蛋白含量。二、 負(fù)染電鏡分析（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備4% paraformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4），1 % Uranyl acetate乙酸雙氧鈾in dd

6、-H2O，石蠟?zāi)ぃ?00 目鎳網(wǎng)（二）實(shí)驗(yàn)步驟1. 將20L exosomes 小體懸樣與4% 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4）1：1混勻。2. 取10L混合物滴于石蠟?zāi)ど希瑢?00目鎳網(wǎng)置于液滴中懸浮10min。3. 用毛邊濾紙從側(cè)面吸干多余液體。4. 在20L PBS液滴中懸浮5min，重復(fù)。5. 在20L 去離子水液滴中懸浮5min，重復(fù)。6. 1% 乙酸雙氧鈾負(fù)染液負(fù)染1 min，用毛邊濾紙從側(cè)面吸干多余液體。7. 將鎳網(wǎng)正面朝上置于濾紙上，在有蓋的玻璃皿中干燥15min。8. 樣品準(zhǔn)備完畢，進(jìn)行EM分析。三、 1D SDS-PAGE（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備Ø 儲(chǔ)存液配制：（1）

7、2 M Tris-HCl（2）100 g/L SDS 溶液（3）75%（v/v）甘油（4）10 g/L 溴酚藍(lán)溶液Ø 電泳工作液配制：（1）Acr-Bis液（2）4×分離膠緩沖液（3）100 g/L 過(guò)硫酸銨溶液（4）TEMED 成品液（5）5×樣品緩沖液（6）10×電泳緩沖液Ø 12% 電泳膠的配制Ø 考馬斯亮藍(lán)染色液和脫色液（二）實(shí)驗(yàn)步驟1.制膠 裝好灌膠器，在分別在兩個(gè)潔凈小燒杯（離心管也可）內(nèi)配制分離膠和濃縮膠混合液（注意灌膠時(shí)再加AP和TEMED），配方見(jiàn)SDS-PAGE溶液配制及具體流程。以槍頭攪拌約10-20 sec，灌

8、膠分離膠。在膠面上小心地鋪上幾毫米厚的水層，然后常溫凝固30 min（膠面與水層間界面清晰說(shuō)明膠已凝好）。此時(shí)倒出水層，濃縮膠混合液加入AP和TEMED，槍頭攪拌均勻，加入灌膠器，上覆水層，然后插入梳子，凝固2h。2.上樣跑膠 打開(kāi)固定玻璃板的塑料夾，取出梳子，取下膠板裝入電泳槽，在電泳槽中加入電泳緩沖液，上槽灌滿，下槽電泳緩沖液的量根據(jù)電泳膠數(shù)目參照電泳槽上的刻度線確定。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，每條泳道上樣量在15 g左右。2×樣品緩沖液與樣品1：1混合，上樣體積一般為15-20L，插入上樣梳上樣。電泳條件：step 1: 80V 5min,step 2: 150V 2h,注意觀察溴酚藍(lán)

9、的位置，一般半小時(shí)左右完成。3.染色及脫色 關(guān)閉電源，取出電泳后的膠板，用刮膠板小心撬開(kāi)玻璃板將膠取下（不可用蠻力，用二次水潤(rùn)濕比較容易取下來(lái)），置于帶蓋的玻璃皿中，加入染色液（以剛沒(méi)過(guò)凝膠即可），于微波爐加熱約40-70 sec至染色液微沸（注意蓋子不要蓋的太緊以防染色液爆沸噴濺），然后于脫色搖床上繼續(xù)染色約10 min。染色液請(qǐng)倒入專用的回收容器內(nèi)。淋洗凝膠沖去剩余染料，然后倒入適量的脫色液，微波加熱至微沸后于搖床上脫色約10 min，重新?lián)Q上脫色液室溫?fù)u床脫色至完全去除背景色。4.掃描及后處理 脫色后的凝膠置于掃描儀上掃描凝膠圖像并保存，不立即酶解的凝膠在二次水中4冰箱保存。（盡快處理，

10、防止蛋白擴(kuò)散和變質(zhì)）四、 1D SDS-PAGE蛋白質(zhì)條帶膠內(nèi)酶解（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備脫色及脫水1. 25 mM NH4HCO3 100 mg NH4HCO3，50 mL dd H2O2. 25 mM NH4HCO3/50 % ACN 100 mg NH4HCO3，25 mL ACN，25 mL dd H2O3. Stock Solution：1 %甲酸 990 L dd H2O，10 L甲酸4. 0.1 %甲酸 100 L Stock solution，900 L dd H2O還原和烷基化5. 10 mM DTT 1.5 mg DTT/25 mM NH4HCO36. 55 mM 碘乙酰胺 10 m

11、g碘乙酰胺/ 25 mM NH4HCO3胰酶消化7. Trypsin（Promega V5113） 12.5 ng trypsin/25 mM NH4HCO3提取肽段8. 50 % ACN/0.5 甲酸 500 L stock solution，500 L ACN質(zhì)譜準(zhǔn)備9. Millipore ZipTip C18 Pipette Tips ?10. Stock solution：1% 甲酸11. Equilibration and washing：0.1 % 甲酸12. Wetting and elution：50 % ACN/0.1 % 甲酸 100 L stock solution，5

12、00 L ACN, 400 L dd H2O（二）實(shí)驗(yàn)步驟1. 將膠條用手術(shù)刀片或保險(xiǎn)刀片按順序切下，每條帶約1.5 mm3大小，7 cm 膠條約切12 15條；2. 將膠條切成1-2 mm2的小塊，置于1.5 mL EP管中，記錄條帶號(hào)及相應(yīng)的位置；3. 用200 L MilliQ超純水振蕩清洗5 min，重復(fù)一次；4. 脫色（1） 加入100 L 25 mM NH4HCO3/50 % ACN，渦旋并孵育10 min,吸干上清；（2） 重復(fù)（1）至藍(lán)色褪去，膠粒萎縮變白；（3） 真空干燥膠粒至全干（20min）。5. 還原烷基化（1） 向干膠粒中加入50 L 10 mM DTT/25 mM

13、NH4HCO3，渦旋。56還原反應(yīng)1 h，冷至室溫；（2） 棄掉上清，立即加入50 L 55 mM碘乙酰胺，渦旋后避光室溫反應(yīng)45 min；（3） 棄掉上清，加入100 L 25 mM NH4HCO3 渦旋并孵育10 min清洗膠粒；（4） 棄掉上清，100 L 25 mM NH4HCO3/50 % ACN渦旋并孵育10 min以脫去膠粒中的水分，重復(fù)1 次；（5） 真空干燥膠粒至全干（20min）。6. 膠內(nèi)酶解（1） 加入3倍于膠粒的酶解液冰浴30 min(或放4冰箱)，使膠粒復(fù)水；（2） 除去過(guò)量的Trypsin溶液后，用50 L 25 mM NH4HCO3清洗膠粒幾次，最后用50 L

14、25 mM NH4HCO3覆蓋膠粒；（3） 渦旋，37反應(yīng)過(guò)夜。7. 提取肽段（1） 將酶解后上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中；（2） 向膠粒中加入30 L 50 % 乙腈/0.1 %甲酸，渦旋孵育30min，并超聲5 min；（3） 吸取上清與第一次的上清合并；（4） 重復(fù)步驟（2）（3）；（5） 渦旋后冷凍濃縮至5-10 L（30min）。加入0.1 %甲酸 15 L，渦旋。五、 質(zhì)譜鑒定1. ZipTip Protocol ？（1） 將50 L樣品加入到96孔板，每個(gè)樣品一個(gè)孔；（2） 將20 L elution solution加入到干凈的離心管中，每個(gè)樣品一個(gè)；（3） Wetting

15、 ZipTip：吸10 L wetting solution入針尖，打出，重復(fù)操作；（4） Equilibrate ZipTip：吸10 L 平衡液 ，打出，重復(fù)操作；（5） Binding：來(lái)回吸、打樣品10次；（6） Washing：吸washing solution，打掉；重復(fù)2次；2. Elution：將離心管中20 L elution solution吸打10次，不要引入空氣；3. 將樣品濃縮至5 L加入15 L 0.1 % 甲酸，混勻后進(jìn)樣；4. 根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果搜庫(kù)。六、 IEF/SDS-PAGE雙向電泳（一）第一向等電聚焦（7cm膠條，pH 3-10）1. 從冰箱中取-20冷凍保存

16、的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1mL/管），置室溫溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4/6、5/7各2.5L，充分混勻。3. 從小管中取出200L水化上樣緩沖液，加入50L樣品，充分混勻。4. 從冰箱取-20冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（7cm pH 3-10），于室溫放置10分鐘。5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品(7cm膠條一般加125-250L，10-100g)。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。6. 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤

17、或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。7. 分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。8. 在每根膠條上覆蓋1.5 mL礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。9. 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。v 7cm膠

18、條水化12小時(shí)（18）主動(dòng)水化（50V）或被動(dòng)水化v S050V rapid12h 水化（若被動(dòng)水化，此步省卻）v S1250Vlinear30min除鹽v S2500Vrapid30min 除鹽v S34000Vlinear3h 升壓v S44000Vrapid20,000Vhr 聚焦v S5500Vrapid99h 保持10.聚焦結(jié)束的膠條應(yīng)立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20冰箱保存。（二）第二向SDS-PAGE電泳1. 配制12%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配12mL凝膠溶液，每塊凝膠6mL，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ

19、水封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水，用MilliQ水沖洗。3. 從-20冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。4. 配制膠條平衡緩沖液I。5在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。6. 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入2.5mL膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。7. 配制膠條平

20、衡緩沖液II。8. 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。10.將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。12.第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡

21、液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。16.放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。17.在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液

22、完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。18.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。19.電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。20.進(jìn)行染色（按照伯樂(lè)染色試劑盒上的操作步驟）Bradford法測(cè)蛋白總濃度檢測(cè)原理: Bradford與蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測(cè)。該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過(guò)0.2%影響測(cè)定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100mL濃磷酸;然后,用蒸餾水補(bǔ)充至2