1、 本 科 生 畢 業 設 計（論 文）開題報告題 目：中藥菊花有效成分的提取及含量測定姓 名：冷 晶學 號：200504030106指導教師：李 楠班 級：藥 劑 051 班所在院系：生命科學與工程學院本科生畢業設計（論文）開題報告考核一、導師對開題報告的評語： 指導教師 200 年 月 日成績二、開題報告答辯評語及成績: 答辯小組負責人 200 年 月 日開 題 報 告一 課題名稱：中藥菊花有效成分的提取及含量測定二 選題目的及意義隨著中藥研究的不斷深入，中藥現代化得到不斷推進，中藥所含物質研究的現代化和中藥質量控制的現代化成為當前中藥現代化研究的兩個重要方面。中藥菊花為菊科植物菊Chrys

2、anthemum morifolium Ramat 的干燥頭狀花序, 以產于浙江的杭白菊最負盛名，享譽全國各地及東南亞地區，是國家衛生部第一批批準的藥食同源的道地藥材之一，具有散風清熱、平肝明目的作用, 臨床應用廣泛。其主要含揮發油、黃酮類有效成分，本課題旨在利用現代科學的理論方法和技術對杭白菊的兩類主要活性成分進行含量測定，并對提取工藝進行研究，同時考察不同種植基地、不同采摘時間、不同炮制工藝及不同等級的杭白菊中有效成分含量變化，從而有助于更好的對杭白菊的質量進行控制以及更合理的開發利用課題有無創新性？。三 研究背景介紹可精簡，重點在國內外對此相關研究的現狀（一）2005版藥典對菊花的介紹1

3、. 性狀菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序。9-11月花盛開時分批采收，陰干或焙干，或熏、蒸后曬干。藥材按產地和加工方法不同，分為“毫菊”、“滁菊”、“貢菊”、“杭菊”。我們以杭菊為研究對象，提取其揮發油，并用氣相色譜法鑒定其主要成分。2005版中國藥典第一部上記載：亳菊，呈倒圓錐形或圓筒形，有時稍壓扁呈扇形，直徑1.5-3cm，離散。總苞碟狀；總苞片3-4層，卵形或橢圓形，草質，黃綠色或褐綠色，外面被柔毛，邊緣膜質。花托半球形，無托片或托毛。舌狀花數層，雌性，位于外圍，類白色，勁直，上舉，縱向折縮，散生金黃色腺點；管狀花多數，兩性，位

4、于中央，為舌狀花所隱藏，黃色，頂端5齒裂。瘦果不發育，無冠毛。體經，質柔潤，平時松脆。氣清香，味甘、微苦。滁菊，呈不規則球形或扁球形，直徑1.5-2.5cm。舌狀花類白色，不規則扭曲，內卷，邊緣皺縮，有時可見淡褐色腺點；管狀花大多隱藏。貢菊，呈扁球形或不規則球形，直徑1.5-2.5cm。舌狀花白色或類白色，斜升，上部反折，邊緣稍內卷而皺縮，通常無腺點；管狀花少，外露。杭菊，呈碟形或扁球形，直徑2.5-4cm，常數個相連成片。舌狀花類白色或黃色，平展或微折疊，彼此粘連，通常無腺點；管狀花多數,外露。2. 鑒別方法取本品1g，剪碎，加石油醚20ml，超聲處理10分鐘，棄去石油醚，藥渣揮干，加稀鹽酸

5、1ml與乙酸乙酯50ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加乙醇制成每1ml含0。5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄 B）試驗，吸取上述兩種溶液各0.5-1l，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（1:15:1:1:2）的上層溶液為展開劑，展開，取出。晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。3. 含量測定照高效液相色譜法（附錄 D）測定。色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液取磷酸二氧納（

6、NaH2PO4·2H2O）15.6g，加水至1000ml制成0.1mol L的溶液，加入磷酸適量，使pH值為2.7-甲醇（70:30）為流動相；檢測波長為328nm。理論板數按綠原酸峰計算應不低于2500。對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，加水制成每1ml含0.2mg的溶液，即得（10以下保存）。供試品溶液的制備 取本品粉末（過一號篩）約1g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流2小時，冷卻，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10ml，蒸干，殘渣加三氯甲烷5m1，浸漬3分鐘，棄去三氯甲烷液，殘渣揮去三氯甲烷、

7、加水適量使溶解，并轉移至5ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（應于當日測定）。測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測定，即得。本品按干燥品計算，含綠原酸（C16H18O9）不得少于0.20。（二）菊花揮發油中的主要成分包括脂肪族、單萜、倍半萜及含氧衍生物。單萜、倍半萜的含氧衍生物多具有較強的生物活性和香氣,是醫藥、化妝品和食品工業的重要原料。劉偉等采用毛細管柱氣相色譜-質譜技術對菊花的揮發油的化學成分進行了初步研究,鑒定出二十余種萜烯類化學成分:-側柏烯、-菲蘭烯、-菲蘭、-松油烯、1,8-桉葉素、叔丁基苯、-萜品烯、蒲勒烯、優葛縷酮、樟腦、龍腦、異龍腦、醋酸冰

8、片酯、芳樟醇、-石竹烯、-欖香烯、假紫羅酮、-松油醇、Dihgdrkhusilol等;并指出因產地及加工炮制方法的不同,揮發油的成分不同,導致其藥效不同。黃保民等利用毛細管氣相色譜-質譜-計算機聯用技術研究懷菊揮發油的化學成分,鑒定了45個化合物,主要成分是-菲蘭烯、對聚傘花烯、菊烯酮、1, 8-桉油精、冰片及檜烯等。周維書等采用氣相色譜-質譜-計算機聯用技術對香菊揮發油成分進行了質譜分析,測定了香菊揮發油含a-蒎烯(16.6% ) 、樟烯( 12.47% ) 、異纈草酸丁酯( 6.8% ) 、冰片(4.42% ) 、-桉醇(7.25% ) 、松油醇(4.12% )等為主的43個成分。其中異領

9、纈草酸丁酯、苦橙油醇、-桉醇在常用藥用菊花或野菊花中很少發現,這三個揮發油成分占揮發油總重的15.88% ,能代表香菊的獨特香氣。（三）菊花揮發油的主要藥理作用1. 抑菌作用 現有研究認為揮發油是菊花抗菌作用的物質基礎,其中的樟腦、龍腦則是其發揮抗菌作用的主要成分。李英霞等對不同產地的菊花揮發油的抑菌作用進行了研究。結果發現,不同產地的菊花對金黃色葡萄球菌、白葡菌、變形桿菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌均有一定的抑制作用,尤其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最明顯。2. 抗腫瘤作用菊花揮發油中含有較多的-欖香烯,而-欖香烯具有廣譜抗腫瘤等廣泛的藥理作用。國家一類新藥-欖香烯乳劑已用于癌癥病人的臨床治療。因

10、此菊花揮發油部位具有潛在的抗腫瘤作用。3. 其他作用丁香烯具有平喘作用,是治療老年性慢性支氣管炎的有效成分之一; 1,8-桉葉素和蒎烯均有較強的抗炎和祛痰作用。（四）氣相色譜法簡介氣相色譜法(Gas Chromatography，GC)是一種重要的分離分析方法。這種技術廣泛應用于石油化工醫藥衛生等許多領域。在藥物的原料中間體成品制劑分析、中藥成分的分離分析、藥物代謝研究、毒物分析及環境檢測等方面，GC是必不可少的工具。它是采用氣體為流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先后進入檢測器，用記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄

11、色譜信號。1.原理氣相色譜法的分離原理基于物質在流動氣體和固定相兩相分配的不同而導致分離。載氣經減壓閥減壓后進入凈化干燥器，通過汽化室進入色譜柱。試樣由進樣器進入汽化室，則液體試樣立即汽化為氣體并被載氣帶入色譜柱。因色譜柱中的固定相對試樣中不同組分的吸附能力或溶解能力不同，從而使試樣中各種組分彼此分離而先后流出色譜柱，并進人檢測器，檢測器得到不同組分的濃度(或質量)變化轉變為電信號，并經放大器放大通過記錄儀即可得到色譜圖。由組分及其濃度即檢測器輸出的樣品信號(電壓或電流)隨時間變化的曲線成為色譜圖。如果分離完全則每個色譜峰代表一種組分，并且根據色譜峰的位置可進行定性分析；根據色譜峰的面積或高度

12、可進行定量分析；根據色譜峰的峰寬和峰間距可評價色譜柱的分離效能和考察操作條件是否恰當等因素。2.分類在GC中，流動相是氣體，固定相是固體吸附劑(氣-固色譜法，gas-solid chromatography，GSC)或涂在惰性固體表面的液膜(氣-液色譜法，gas-liquid chromatography GLC)。其中以GLC應用最為廣泛。3.特點氣相色譜具有高選擇性、高靈敏度和高分辨率。高選擇性指GC能分離結構極為相似的異構體(位置異構、結構異構和空間異構)等，并可用于制備色譜純物質。高靈敏度是指GC可測定ppm、ppt級的物質。高分辨率是指GC的一般填充柱約為每米2000理論塔板數，而毛

13、細管柱可達每米1051O7理論塔板數。 4. 氣相色譜法測定揮發油的缺點所選用的指標成分不能代表組成復雜的揮發油，實驗的結果完全取決于所選用的指標成分的穩定性如何，因此從揮發油組成成分性質差異大的角度考慮，至少需要2種或2種以上的化學成分，其中一種的極性較大(揮發性較小)，另一種極性較小(揮發性較大)，根據2個不同性質的化學指標的穩定性實驗結果綜合評價揮發油整體的穩定性情況。同理，在制劑工藝考察，成藥制劑質量控制等方面，也應該考慮選用2種或2種以上的極性差異較大的化學成分，使評價結果更客觀真實。三 實驗方案初定（一）菊花中揮發油的提取1. 提取方法1) 2005版藥典中的提取方法 取一定碎度的

14、菊花100g，精密稱定（準確至0.01g），置2000mL圓底燒瓶中，參照2005版中國藥典I部附錄XD，加水800mL與玻璃珠數粒，振搖混合后，連接揮發油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，置電熱套中加熱至沸，調溫并保持微沸5h，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端活塞將水緩緩放出，收集揮發油，無水硫酸鈉脫水，得到淡黃色揮發油，精密稱重，計算提取率。 2) 超聲波提取法 將100g菊花磨碎后置于燒杯中，加入7倍量的水，用超聲波振蕩處理，超聲頻率40Hz、超聲處理時間25min、冷卻至室溫，用45加熱提取完畢后，過濾收集揮發油并稱重，揮發油為藍色

15、，具有特殊香味，收率為0.32mL100g.3) 索氏提取法 取杭白菊20克，剪碎，置索氏提取器中，加乙醚300mL，55水浴加熱5h，回收乙醚，得到浸膏。浸膏用乙醇熱提取，放冷過濾，回收乙醇，出凈油量較少。 2. 菊花揮發油提取的單因素實驗 前期預實驗研究發現，菊花揮發油得率與其粉碎度、加水量、浸泡時間、蒸餾時間有關系，因此首先通過單因素實驗考察提取菊花揮發油的工藝條件。1) 粉碎度對菊花揮發油提取率的影響設菊花粉碎度為整棵、剪段、2040目、406o目、6080目、80 100目、100目以上，10倍加水量，2 h浸泡時間，5 h蒸餾時間下進行水蒸氣蒸餾提取，稱量并計算提取率。根據擴散定律

16、：藥材粉碎度愈細，浸出效果愈好，成分得率愈高。2) 加水量對菊花揮發油提取率的影響設加水量為8，10，12，14，16，18，20倍，粉碎度為粉碎的混合顆粒，浸泡2 h，蒸餾5 h下進行水蒸氣蒸餾，稱重并計算提取率。3) 浸泡時間對菊花揮發油提取率的影響設浸泡時間為0，2，4，6，8，10，12 h，粉碎度為粉碎的混合顆粒，10倍加水量，蒸餾5 h下進行水蒸氣蒸餾，稱重并計算提取率。4) 蒸餾時間對菊花揮發油提取率的影響設蒸餾時間為35，5，7，9，10，11，13，15 h，粉碎度為粉碎的混合顆粒，10倍加水量，2 h浸泡時間下進行水蒸氣蒸餾，稱重并計算提取率。3. 提取工藝參數的優化一正交

17、實驗正交實驗設計根據單因素結果，以揮發油提取率為評定指標，選擇菊花粉碎度(A)、浸泡時間(B)、加水量(C)和蒸餾時間(D)為考察因素，每個因素3個水平，選用 L9(34)正交表，實驗安排見表。水平ABCD粉碎度/目浸泡時間t/h加水量/倍蒸餾時間t/h1204021072408061210380100101413（二）菊花揮發油中樟腦、龍腦、一欖香烯等的氣相測定1. 色譜條件方案一: DB-1毛細管柱(30m×0.32mm×0.25µm);程序升溫從70以4/min升至100, 再以10/min升至150, 最后以30/min升至250;無分流進樣時間1min;

18、分流比101;氫火焰離子化檢測器(FID); 進樣口溫度為220;載氣為氮氣,體積流量:2.0 mL/min, 空氣的體積流量為500mL/min, 氫氣的體積流量為50mL/min;進樣量: 1µL.方案二：Agilent HP-5毛細管色譜柱(30m×0.32mm×0.25µm)。程序升溫從70以2.5/min升至140，再以10/min升至260，氣化室溫度280，檢測器FID溫度300，分流比20：1，氮氣流速1mL/min，空氣350 mL/min，氫氣70 mL/min.2. 內標物 選用正辛醇為樟腦、龍腦內標，正十四烷作為-欖香烯的內標。3

19、. 內標溶液的制備 精密稱取正辛醇262mg、正十四烷2678 mg，用正己烷溶解并定容至10mL，作為內標儲備液，該儲備液再以正己烷稀釋成0655 mg/mL 正辛醇和6695 mg/mL 正十四烷的內標溶液。4. 對照品儲備液的制備 分別精密稱取樟腦119 mg、龍腦133 mg、-欖香烯800 mg，以正己烷溶解并定容至一定體積，分別制成5950 mg/mL、1662 mg/mL及l6O0 mg/mL的對照品儲備液，搖勻，備用。5. 供試品溶液的制備 按藥典法提取所得揮發油，用正己烷溶解并定容至2 mL，精密量取08mL置1 mL量瓶中，精密加入內標溶液01 mL，用正己烷定容至刻度，搖

20、勻。6. 標準曲線的制備 從對照品儲備液中分別精密移取樟腦溶液120µL、龍腦溶液220µL、-欖香烯溶液1250µL，加入內標溶液200µL，以正己烷定容于2 mL量瓶中。再依次稀釋2，4，8，16倍，并添加內標保持內標濃度恒定。取1µL進樣，以上述色譜條件測定。以對照品濃度(C)為縱坐標，對照品峰面積與相應內標物峰面積之比(X)為橫坐標進行線性回歸。7. 儀器精密度實驗 取6.項下稀釋4倍的溶液測定，按上述色譜條件進樣1µL測定峰面積，計算對照品峰面積與相應內標峰面積之比。8. 重復性實驗 取同一樣品5份，平行提取，測定。9. 穩定性實驗 取同一份供試品溶液，于0，1，3，7，24 h分別進樣，計算待測成分峰面積與相應內標峰面積之比。10. 回收率實驗 采用加樣回收率實驗，精密稱取已測知含量的菊花樣品(杭白菊)9份，每3份一組，按高、中、低3個水平分別精密加入一定量對照