1、內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的研究進展摘 要：內源乳化法是近年來興起的一種海藻酸鹽微膠囊制備方法，在制備過程中使用的都是無毒試劑和溶劑，可在生物、食品、醫藥等行業中用于包埋生物活性物質。本文著重介紹了內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的原理，比較了內源乳化法與外源乳化法的異同，分析了制備過程中影響微膠囊性質的因素，歸納了近年來其在生物活性物質包埋中的應用，并展望了內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的發展前景。關鍵詞：內源乳化法，微膠囊，海藻酸鹽，生物活性物質Research progress in emulsification/internal gelation technology forthe pre

2、paration of alginate microcapsulesAbstract：Emulsification/internal gelation is a newly developed method for encapsulation in recent years. As allreagents and solvents used during the microcapsule preparation are nontoxic ， the emulsification / internalgelation method has been adapted to encapsulate

3、sensitive bioactive substances in biotechnology，food andmedicine industries. In this paper，it was described the encapsulation mechanism of emulsification/internalgelation，compared these differences between emulsification/internal gelation and emulsification/external gelation，discussed important form

4、ulation parameters during the process，and summarized its applications in differentsensitive bioactive substances. Finally，the development of this technique in the future was prospected.Key words：emulsification/internal gelation；microcapsule；alginate；bioactive substances中圖分類號：TS201.1 文獻標識碼：A 文 章 編 號：

5、1002-0306（2013）22-0392-05收稿日期：20130607 * 通訊聯系人作者簡介：趙萌（1983-），女，博士研究生，講師，研究方向：食品功能因子的保護和增益?；痦椖浚汉笔∽匀豢茖W基金面上項目（2012FFB00705）。海藻酸鈉是一種天然的微膠囊壁材，具有免疫原性低、生物相容性好、可降解且產物無毒副作用、價格低廉等特性，是最常用的生物活性微膠囊制備材料。海藻酸鹽微膠囊制備方法較多，如擠壓法、電噴霧法、乳化法等，其中內源乳化法是近年來興起的一種方法，已陸續成功地包埋乳酸菌1-5、DNA6-9、牛血清蛋白10、血紅蛋白11-12、胰島素13-14、溶菌酶15、葡萄糖氧化酶

6、16、卡介苗17、胰島細胞18-19、蘇云氏芽孢桿菌20、厭氧菌21等生物活性組分。由于制備過程中使用的都是無毒試劑和溶劑，因而內源乳化法可應用于生物、食品、醫藥等行業中包埋生物活性物質。本文著重介紹了內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的原理，比較了內源乳化法與外源乳化法的異同，分析了制備過程中影響微膠囊性質的因素，歸納了近年來其在生物活性物質包埋中的應用進展，并進一步指出了內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的利弊，為進一步制備生物活性物質微膠囊提供參考。1 內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊1989年Lencki等首次提出了內源凝膠化（Internalgelation）的概念22。在此基礎上，Poncelet

7、等建立了內源乳化法（Emulsification/internal gelation），設計了該法所需的反應器和攪拌槳，系統分析了內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的各項參數，成功地制備出小尺寸、表面光潔的球形海藻酸鈣凝膠珠23。1.1 內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的過程及原理內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的過程為：a.將H+油相H+水/油界面H+Ca2+H+Na+AlgCalciumsalt圖1 內源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的反應過程Fig.1 Emulsification/internal gelation process for thepreparation of alginate microc

8、apsules392專 題 綜 述2013年第22期Vol . 34 , No . 22 , 2013海藻酸鈉溶液、水不溶性鈣鹽及包埋物共混；b.將此混合物分散到油相中形成W/O型乳化液；c.加入酸，引發鈣鹽中Ca2+的解離，促使Ca2+在乳液液滴內部與海藻酸鈉作用生成海藻酸鈣凝膠珠；d.加入緩沖溶液，水相、油相發生相分離，靜置，收集海藻酸鈣凝膠珠。因Ca2+來自海藻酸鈉液滴內部的不溶性鈣鹽，鈣離子與海藻酸鈉在液滴內部原位形成凝膠，故稱為內源乳化法，又稱內源乳化凝膠法。其反應過程如圖1所示。當酸從水/油界面擴散通過后，會引發兩個連續的反應：a.以碳酸鈣為例，均勻分散的質子擴散到含水凝膠相與碳酸

9、鈣顆粒相遇，瞬間釋放鈣離子（式1）；b.海藻酸鹽原位凝膠，形成均勻的凝膠網絡（式2）24。CaCO3+2H+ Ca2+H2O+CO2式（1）Ca2+2NaAlg Ca（Alg）2+2Na+式（2）1.2 內源乳化法與外源乳化法的比較1983年，Nilsson等25為了克服擠壓法的缺點，發明了外源乳化法（Emulsification/external gelation）制備海藻酸鹽微膠囊。其制備過程為：a.將海藻酸鈉溶液和包埋物共混；b.此混合物分散到油相中形成W/O型乳化液；c.緩緩加入氯化鈣溶液，促使Ca2+與乳液液滴中的海藻酸鈉作用生成海藻酸鈣凝膠珠；d.靜置，收集海藻酸鈣凝膠珠。因Ca2

10、+來源于海藻酸鈉液滴外的氯化鈣溶液，鈣離子從海藻酸鈉液滴外側擴散進入液滴而逐漸形成凝膠，故稱為外源乳化法，又稱外源乳化凝膠法，反應過程如圖2所示。與外源乳化法相比，內源乳化法采用難溶性鈣鹽作為鈣源，克服了外源乳化法中氯化鈣溶液加入引起的微膠囊成簇凝聚現象，使得微膠囊粒徑易于控制，可形成粒徑更小的微膠囊，且顆粒粒徑比較均一23。陽輝等2采用外源乳化法和內源乳化法兩種方法制備了嗜酸乳桿菌微膠囊，結果表明：兩種方法均可用于乳酸菌微膠囊的制備，但相比較而言，外源乳化法包封率為61.3%，內源乳化法包封率可提高到72.5%，且內源乳化法微膠囊的粒徑分布范圍更窄、表面更光滑、呈球性更佳。Song等5采用熒

11、光標記-共聚焦激光掃描顯微鏡法，直觀地顯示出內源乳化法微膠囊的結構均一性和圓球度好于外源乳化法微膠囊。2 內源乳化法過程中影響海藻酸鹽微膠囊性質的因素2.1 海藻酸鹽組成與濃度海藻酸鹽是由-L-古羅糖醛酸（G）和-D-甘露糖醛酸（M）兩種單體通過（14）鍵連接形成的線性嵌段共聚高分子，單體G和M在海藻酸鹽主鏈上呈三種類型的嵌段分布：M和G交替嵌段（MGMGMGM.）、G嵌段（GGGGGGG.）及M嵌段（MMM-MMM.）26。海藻酸鹽在水中的溶解度依賴于pH及其陽離子形式，海藻酸鈉是一種水溶性的化合物，并在Ca2+、Zn2+等二價陽離子的存在下形成凝膠。海藻酸鹽凝膠珠的性質首先取決于海藻酸鹽單

12、體和金屬離子組成。一方面，單體G含量和均聚物嵌段含量高的海藻酸鹽與鈣離子作用強，生成強度大、性質更為穩定的凝膠；另一方面，在乳化過程中，高G含量使得海藻酸鹽過早凝膠化，從而形成多孔、大粒徑而不均一的凝膠珠，而高M含量海藻酸鹽形成的弱凝膠彈性更好，具有良好的凍融行為27。另外，海藻酸鹽中鈉與鈣的百分含量會強烈地影響海藻酸鹽微膠囊的溶脹和愈合屬性28。海藻酸鹽凝膠珠的性質與制備過程中使用的海藻酸鈉濃度密切相關。當其濃度低于1.0時，很難形成球形顆粒；隨著海藻酸鈉濃度升高，溶液粘度增加，形成粒徑較大、分布較寬的微膠囊29。因而，海藻酸鈉濃度的選擇應考慮實際應用對微膠囊顆粒大小、形狀和均一性的要求，如

13、食品中微膠囊粒徑大于200m時口感會比較粗糙30。2.2 二價陽離子的類型、離子載體形式及濃度海藻酸鹽凝膠珠的性質與二價陽離子的類型及其載體形式密切相關。首先，海藻酸鹽凝膠強度與陽離子類型的關系為：Mg2+Ca2+Zn2+Sr2+Ba2+。雖然有文獻報道使用鋅離子制備海藻酸鹽凝膠珠31，但由于鈣離子的臨床安全性、方便和經濟，制備海藻酸鹽凝膠珠大多還是使用鈣離子。內源乳化法使用的鈣離子載體取決于形成凝膠珠所需的起始及最終pH，在該起始pH下鈣離子載體應幾乎不解離鈣離子，但在降低pH的過程中會迅速釋放鈣離子。對細胞固定化而言，pKa值落在6.57.5范圍間的陰離子都是適用的鈣離子載體，如草酸鹽、酒

14、石酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽和檸檬酸鹽32。其中，碳酸鈣是最為常用的鈣離子載體，其凝膠珠球形好、性質穩定，通常能得到尺寸分布較窄的凝膠珠，同時碳酸鈣與海藻酸鈉的懸浮液可在較寬的pH范圍內保持穩定32。另外，海藻酸鹽凝膠珠的性質與鈣離子濃度相關。當鈣與海藻酸鈉單體的比例為14時，即可確保凝膠珠的強度。繼續增加鈣濃度會導致凝膠珠中殘留不溶性鈣鹽27。最后，海藻酸鹽凝膠珠的性質與鈣鹽顆粒尺寸相關。鈣鹽粉末粒徑越小，越容易進入微膠囊液滴，其溶解速度更快，所形成的凝膠珠球形更好，且更不易聚集。因而，可使用微米級、納米級碳酸鈣進行制備海藻酸鹽微膠囊。另外，文獻報道使用超聲波分散碳酸鹽顆?？墒沟媚z后的凝膠珠內沒

15、有殘留碳酸鈣顆粒6。2.3 pH包埋過程使用的pH范圍取決于鈣離子載體形式、包埋物活性對pH的敏感程度等多個參數。中性油相水/油界面Ca2+Na+AlgCa2+Ca2+Ca2+圖2 外源乳化法制備海藻酸鹽微膠囊的反應過程Fig.2 Emulsification/external gelation process for thepreparation of alginate microcapsules393Science and Technology of Food Industry專 題 綜 述2013年第22期pH范圍適合一般細胞的固定化，乳酸菌等耐酸性的菌體可使用較低pH，其終點pH可降低

16、到56。另外，包埋蛋白質時，pH的選擇必須考慮蛋白質等電點對其穩定性、溶解度等因素的影響10-13，16。2.4 油型海藻酸鹽凝膠珠平均粒徑與油脂粘度存在著相關性，Esquisabelr等研究了微膠囊粒徑大小與油脂粘度間的關系，得到模擬公式（m）=76.6-0.628（mPa·s）（r2=0.943）17，即粘度越大，微膠囊粒徑越小，因而在一定程度上可通過油脂粘度來調控微膠囊粒徑大小。另外，乳化過程中水相/油相比例會影響微膠囊的包埋率、粒徑分布等性質。通常情況下，水相和油相的比例范圍在12和15之間22，可根據不同的包埋物進行優化。2.5 乳化劑的類型及濃度內源乳化法的第一步是乳化過

17、程，因而乳化劑的類型和濃度會影響微膠囊的性質。文獻中內源乳化法制備微膠囊使用的乳化劑主要有span 80、span85、tween 80、卵磷脂等。乳化劑在內源乳化法乳化過程中有兩個功能：a.降低水相和油相之間的界面張力，使粘性海藻酸鈉溶液更容易分散到油相中；b.使乳液穩定，防止乳液液滴聚集29。微膠囊制備過程中，乳化劑濃度十分重要。隨著表面活性劑濃度從0.5%增加到2.0時，海藻酸鹽凝膠珠的粒徑大小顯著下降。表面活性劑吸附到分散的液滴相表面而形成一層薄膜來防止乳液液滴間的聚結，因而低濃度的表面活性劑不能完全覆蓋分散相表面，從而引起液滴穩定性下降，聚結生成較大的液滴。另一方面，油溶性酸必須擴散

18、通過油水界面而啟動凝膠化反應，高的表面活性劑濃度可能會增大酸的傳質阻力，延長凝膠化，導致微膠囊顆粒產量低，因而大于2.0的乳化劑濃度不利于微膠囊制備29。2.6 酸的類型內源乳化法過程中使用油溶性酸，這是因為油溶性酸添加到油相中，可使得有機酸立即分配到水相中，從而瞬間降低液滴pH，增加結晶鈣的溶解性，觸發快速凝膠化22。油溶性酸種類很多，但通常選擇的是乙酸、檸檬酸和乳酸，其中乙酸使用次數最多。酸的濃度必須精心計算，在促進鈣的充分釋放的同時不會剩余過多的酸，否則可能會破壞包埋物的活性。3 內源乳化法在生物活性物質包埋中的應用3.1 乳酸菌乳酸菌的保護一直是食品科學領域的研究熱點，但由于乳酸菌的高

19、度熱、機械、化學敏感性，其有效包埋方法的建立一直沒有得到很好的解決。近年來，許多食品跨國公司和研究機構投入了大量精力和財力進行乳酸菌微膠囊化研究。Larisch等1首次采用內源乳化法將乳酸乳球菌包埋在海藻酸鹽微膠囊中，用于乳品工業中制造酸奶、發酵奶油、奶酪醬等。陽輝等2系統研究了海藻酸鹽-內源乳化法和海藻酸鹽-外源乳化法包埋嗜酸乳桿菌的工藝條件，結果表明海藻酸鹽-內源乳化法制備的微膠囊包埋率較高、粒徑分布范圍更窄、表面更光滑、呈球性更佳。王艷等3使用海藻酸鈉及海藻酸鈉&殼聚糖混合物兩種壁材，以內源乳化法包埋了嗜熱鏈球乳桿菌，其中殼聚糖/海藻酸鹽微膠囊在模擬胃液保溫3h后乳酸菌仍有發酵活

20、力，放于冰箱中4保存2個月，菌體存活率保持在94.8%。Zou等4以海藻酸鈉為主要壁材，選取了淀粉、果膠、殼聚糖和多聚賴氨酸等四種多糖復配對海藻酸鹽微膠囊進行改進，評價了不同強化手段對微膠囊特性和乳酸菌保護效果的影響，結果表明：各強化手段對海藻酸鹽微膠囊乳酸菌包埋率影響不大，均在43%50%；殼聚糖/海藻酸鹽微膠囊對乳酸菌保護效果最好，在模擬胃腸液中殼聚糖/海藻酸鹽微膠囊的乳酸菌存活數比海藻酸鹽微膠囊高了1.0個對數值，經30d儲藏后殼聚糖/海藻酸鹽微膠囊的乳酸菌存活數最高。Song等5采用內源乳化法和外源乳化法制備了殼聚糖/海藻酸鹽乳酸菌微膠囊，兩者包埋率均為80%左右，熒光標記-共聚焦激光

21、掃描顯微鏡結果表明：內源乳化法微膠囊結構均一，圓球度好；外源乳化法微膠囊結構不均，呈現外硬內軟的結構分布，圓球度差。與化學組分相比，乳酸菌包埋的難度為：a個體較大，微米尺寸，不易包埋，文獻報道內源乳化法最高包埋率為80%5，遠低于分子尺寸化學組分；b乳酸菌具有生命活性，其包埋過程本身會對乳酸菌存活造成一定的傷害；c乳酸菌個體差異大，不同種、屬、株來源的乳酸菌對環境的耐受性不同，很難進行數據重現實驗，不同作者的數據可比性較差。3.2 DNAQuong等6-8首次采用內源乳化法將DNA包埋到海藻酸鹽微球中，考查了在核酸酶、水解酶存在下微膠囊對DNA的保護效果，結果表明小分子量殼聚糖和大分子聚賴氨酸

22、包衣的海藻酸鹽微球使核酸酶對DNA維持雙鏈結構的時間大大延長。另外，Quong等9以DNA為模型物，采用外源乳化法和內源乳化法制得的海藻酸鹽微膠囊，比較了兩種微膠囊的包埋率、結構及DNA的保護效果等參數，結果表明：內源乳化法包埋率80%，擠壓法包埋率97%；內源乳化法形成內外較為均一的結構，外源乳化法形成內外非均勻結構；微膠囊在制備、保存和模擬胃腸條件下的微膠囊重量變化表明內源乳化法更有利于DNA保護。3.3 蛋白質目前，內源乳化法包埋的蛋白質有牛血清蛋白、血紅蛋白、胰島素、溶菌酶等。Vandenberg等10分別用擠壓法和內源乳化法制備了牛血清蛋白的海藻酸鹽-殼聚糖微膠囊，比較了這兩種微膠囊

23、中的牛血清蛋白在凝膠化、沖洗等加工過程和模擬胃腸液中的擴散情況，結果表明內源乳化法的擴散現象較為嚴重、包埋率較低。Ribeiro等11使用殼聚糖包衣成功降低了血紅蛋白的擴散現象，同時使用DSC和FTIR來考察海藻酸鈉和殼聚糖間的相互作用，結構表明海藻酸鈉羧基和殼聚糖氨基間存在著靜電相互作用。394專 題 綜 述2013年第22期Vol . 34 , No . 22 , 2013Silva等12系統研究了海藻酸鈉-殼聚糖內源乳化法制備血紅蛋白微膠囊的工藝過程，以微膠囊粒徑、包埋率為指標，優化了鈣膠比、油水比、攪拌速度、乳化劑含量等多個參數。在此基礎上，Silva等13-14又進一步以海藻酸鈉為主

24、的復合壁材研究內源乳化法制備胰島素微膠囊的工藝過程，海藻酸鈉與其他多糖的復合使用會影響到胰島素的包埋率，其中硫酸葡聚糖或硫酸纖維素與海藻酸鈉共混提高了胰島素的包埋率，硫酸葡聚糖、硫酸纖維素或聚磷酸鹽與海藻酸鈉共混大大降低了其在模擬胃液中的釋放率。劉若男等15研究了殼聚糖-海藻酸鈉內源乳化法制備溶菌酶微膠囊的工藝條件，得到了模擬胃液處理后溶菌酶仍保留90.0%活性的實驗結果。Wang等16用內源乳化法包埋了葡萄糖氧化酶，制備了平均粒徑為26m的殼聚糖/海藻酸鹽微膠囊，在酶等電點附近的pH4.0下將酶與海藻酸鈉共混得到的包埋酶活總量最高，儲藏60d后，固定化酶可保持70.4%初始酶活，遠高于自由酶

25、殘存酶活7.5%，該文獻制備的殼聚糖/海藻酸鹽葡萄糖氧化酶微膠囊可作為面粉改良劑而應用于實際生產中。3.4 其他細胞因微膠囊包埋可以避免個體對細胞移植的免疫排斥作用，細胞微膠囊逐漸引起了眾多醫學界研究者的興趣。Esquisabelr等17首次將內源乳化法應用于包埋卡介苗，獲得了粒徑尺寸40m左右的微膠囊。Hoesli等18-19采用內源乳化法包埋老鼠胰島細胞，細胞存活率高達90%以上，采用5%海藻酸鈉濃度時未見免疫排斥，2d后即可大大降低血液中的葡萄糖含量，且可在細胞移植10d后胰島素表達量提高（67±32）倍，十分適用于原發性胰腺外分泌細胞移植。Garcia-Gutierrez等2

26、0用內源乳化法制備了蘇云金芽孢桿菌的芽孢-晶體蛋白聚合體的海藻酸鈉微膠囊，平均粒徑在10m以下，可有效提高芽孢-晶體蛋白聚合體對紫外線照射的抗性，在236J中波長紫外線照射下，芽孢存活率、晶體蛋白活性可分別保持60%、40%，極大地改善了芽孢-晶體蛋白聚合體對環境中惡劣因素的敏感性。Borner等21用內源乳化法包埋了厭氧菌梭狀芽胞桿菌，優化了微膠囊制備條件，在100r/min、以甲酯化的油菜籽油為油相條件下，制備的微膠囊中94%的球體僅包埋一個菌體細胞，此單細胞微膠囊在有氧條件下培養可形成微菌落，這一報道拓展了海藻酸鈉微膠囊在厭氧菌培養領域中的應用。4 內源乳化法制備生物活性微膠囊的發展前景

27、隨著食品醫藥產業越來越重視生物活性成分在人體效能的發揮，功能性食品組分的微膠囊及新穎釋藥劑型的開發逐漸成為研究熱點。內源乳化法是近年來興起的一種海藻酸鹽微膠囊制備方法，與外源乳化法相比，內源乳化法具有粒徑可控、工藝容易放大、微膠囊不易聚集等優點，是研究微膠囊對生物活性物質保護機理的有利工具。其制備過程安全無毒，可用來包埋生物活性物質，從而廣泛應用于生物、食品、醫藥等行業中。但內源乳化凝膠法還存在一些不足之處，其制備過程繁瑣，需要添加油脂做分散相，提高了工藝成本，因而，目前對內源乳化凝膠法的研究多停留在實驗室階段，還未應用于工業生產中。但內源乳化法可控制微膠囊粒徑大小、可使用較高的海藻酸鈉濃度，

28、對生物活性物質的保護和可控釋放相當有利，隨著醫藥、保健品行業中對細胞微膠囊、高生物活性物質微膠囊等高附加值產品的開發，內源乳化法包埋生物活性物質必將獲得長足發展。參考文獻1 Larisch BC ， Poncelet D ， Champagne CP ， et al .Microencapsulation of Lactoccocus lactis subsp . cremoris J.Journal of Microencapsulation，1994（11）：189-195.2 陽輝. 腸溶性嗜酸乳桿菌微膠囊制備方法及特性研究D.楊凌：西北農林科技大學，2006.3 王艷. 內源乳化凝膠法

29、制備嗜熱鏈球菌微膠囊及其性質的研究D. 青島：中國海洋大學，2008.4 Zou Q ， Zhao J ， Liu X ， et al . Microencapsulation ofBifidobacterium bifidum F-35 in reinforced alginate microspheresprepared by emulsification / internal gelation J. InternationalJournal of Food Science & Technology ，2011，46（8）：1672 -1678.5 Song H，Yu W，Gao

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