1、 Western實(shí)驗(yàn)步驟     Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。 1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)     可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相

2、關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(P0028)。     收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。 2. 電泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAG

3、E凝膠配制     SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A)。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。 (2) 樣品處理     在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配

4、制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015)。     100或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 (3) 上樣與電泳     冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。     為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066)。     電泳時(shí)電泳液可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液(P0014A/P0014B)。

5、    電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))(EEP102)。為了電泳方便起見，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。    通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可

6、停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)     我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。     通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過

7、夜。轉(zhuǎn)膜時(shí)也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))(EEP102)。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。    在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。     轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用2 / 3麗春紅染色液(P0022)對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液

8、(P0017)對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 4. 封閉(Blocking)     轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。     用微型臺(tái)式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(P0023B)，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以4封閉過夜。在整個(gè)W

9、estern過程中我們推薦使用碧云天的側(cè)擺搖床(ESHK02)或類似儀器，側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)     參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗。     用微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4緩慢搖動(dòng)孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。  &#

10、160; 回收一抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。     注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通?？梢赃x用Tubulin抗體(AT819)或Actin抗體(AA128)，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)     參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液(P00

11、23D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。 二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多種二抗提供。     用微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。     回收二抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。7. 蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)     參考相關(guān)說明書，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來檢測(cè)蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒(FFC58/FFC83)進(jìn)行。     洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試