1、第 2 頁 共 12 頁皮膚光變態反應試驗SkinPhotoallergyTest1. 范圍本方法規定動物皮膚光變態反應試驗的基本原則、要求與方法本方法適用于化妝品原料和產品的皮膚光變態反應檢測2. 規范性引用文件GB14924.3-2010實驗動物配合飼料營養成分GB14925-2010/XG1-2011實驗動物環境及設施國家標準第1號修改單光感作性。化粒品G安全性言刊而仁H馬指金十2015（日本化粒品工H速合會編，2015年11月27日出版，蕖事日幸艮社）3. 試驗目的本試驗用于評估與預測人體重復接觸化妝品原料及其產品，并在日光照射下引起皮膚光變態反應的可能性。4. 定義4.1 光敏性（P

2、hotosensitivity）廣義的光敏性包括光毒性（Phototoxicity，又稱為光刺激性，photoirritation）與光變態（Photoallergy）。4.2 皮膚光變態反應（皮膚光過敏反應，SkinPhotoallergy）皮膚接觸受試物并經過紫外線照射，通過作用于機體免疫系統，誘導機體產生光致敏狀態，經過一定間歇期后，皮膚再次接觸同一受試物并在紫外線照射下，引起特定的皮膚反應，其反應形式包括：紅斑，水腫等。5. 原理皮膚光變態反應是一種細胞介導的由光激活的皮膚免疫性反應，是IV型過敏反應的特殊類型，系光感物質經皮吸收或通過循環到達皮膚后與吸收的光線在表皮細胞層發生的不良反

3、應。目前較為公認的原理為：光感物質吸收光能后成激活狀態，并以半抗原形式與皮膚中的蛋白結合成受試物一蛋白結合物，經表皮的郎罕氏細胞傳遞給免疫活性細胞，引起淋巴細胞致敏等免疫反應。致敏的淋巴細胞再次接觸同一抗原時釋放出淋巴因子，導致一系列有害反應。6. 試驗的基本原則6.1 光化學品安全性評價的一般原則具有光穩定性，化妝品原料在紫外可見（UV/VIS）光譜（290-700nm）有吸收，以及根據SAR結果提示具有潛在的或不良的光效應。如果某物質在290-700nm的摩爾消光系數不超過1000L/mol.cm時，無需提供光過敏試驗的相關數據。6.2 實驗動物頸部去毛皮膚通過多次皮膚涂抹誘導劑量的化妝品

4、原料后（可提前給予佐劑、皮膚損傷處理以增強敏感性）且多次暴露于一定劑量的紫外線（日光）下，誘導特定免疫系統（誘導階段），經過一定間歇期后，在動物背部去毛皮膚給予激發劑量的受試物后暴露于一定劑量的紫外線（日光）下，觀察實驗動物并與對照動物比較對激發接觸受試物的皮膚反應強度。6.3 實驗動物與飼養環境一般選用健康、成年雄性或雌性白色豚鼠，體重350500g，雌性動物應選用未孕或未曾產仔的。實驗動物及實驗環境設施應符合國家相應標準。選用豚鼠維持飼料，飲用無菌純化水，注意以合適的方式補充適量Vc。6.4 動物試驗前準備試驗前動物要在實驗環境中至少適應3d5d。將動物隨機分為受試物組、陰性（溶劑）對照組

5、、陽性對照組，誘導接觸開始24h前在動物頸部給動物備皮（去毛），避免損傷皮膚。試驗開始和結束時應記錄動物體重。6.5 無論在誘導階段或激發階段均應對動物進行全面觀察包括全身反應和局部反應，并作完整記錄。7. 試驗方法根據日本化妝品安全性評價指南（2015）中“光變態反應試驗”中的推薦，本試驗方法選用AdjuvantandStrip（佐劑和角質剝離）法。以下動物試驗方法以AdjuvantandStrip（佐劑加角質剝離法）為例。7.1 動物與分組動物分為受試物組，陽性對照組，陰性對照組；每組至少5只動物。如果試驗目的包含獲取受試物致敏強度值，并對受試物進行光變態強度的分級，則每組至少需要10只動

6、物。7.2 劑量水平誘導接觸階段的受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應的最高濃度，激發接觸階段的受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應的最高濃度。試驗濃度水平可以通過少量動物（23只）的預試驗獲得。受試物、陽性物、陰性對照的誘導與激發濃度選擇：通過預試驗，排除原發皮膚刺激性與光毒性后的合適的濃度。通常選取的陽性物在所選取的濃度下其致敏率應為輕度或中度。7.3 陽性物常用較強的陽性物為四氯代水楊酰苯胺（tetracholosalicylanilide,TCSA）或其它多鹵代水楊酰苯胺（如三溴代水楊酰苯胺，3,5,4-Tribromosalicylanilide，TBS）。弱的陽性物可選擇6-甲基香豆素、

7、硫氯酚等。常用陽性物的溶劑為丙酮、乙醇或二者按一定比例的混合物。每次試驗均需設陽性對照物組。7.4 增敏劑的配制本試驗以1：1（v/v）完全弗氏佐劑（FCA）與生理鹽水的混合物作為誘導階段的增敏劑。7.5 UV光源7.5.1 光源選擇通常受試物的活化吸收波長需包含在所選光源的光譜范圍之內。誘導階段與激發階段均選擇波長為320nm400nm的UVA,如含有UVB,其劑量不得超過0.1J/cm2。7.5.2 照射劑量誘導階段與激發階段照射劑量均設為10.2J/cm2。7.5.3 強度的測定用前需用輻射計量儀在實驗動物肩部（誘導階段）、背部（激發階段）照射區設數個點測定光強度（mW/cm2）,以平均

8、值計。7.5.4 照射時間的計算：以照射劑量為10.2J/cm2為例，按下式計算照射時間。照射劑量（10200mJ/cm2）照射時間（min）=光強度mJ/（cm2s）60注：1mW/cm2=1mJ/cm2/sec7.6 試驗步驟7.6.1 備皮正式試驗前l8-24h將動物頸部皮膚去毛，去毛面積約為2X4cm2,試驗部位皮膚需完好，無損傷及異常。7.6.2 光誘導階段的處理在動物頸部去毛區的四角分別皮內注射0.1mlFCA與生理鹽水的1:1（v/v）混合乳劑（只注射一次），然后在敷用區域以透明膠帶粘附并揭開，反復數次以剝去部分表皮角質層，再將受試物（陽性對照組、陰性對照組則涂抹陽性物或陰性（溶

9、劑）對照物）約0.1ml（g）均勻開放涂抹在去毛區，30min后用UVA進行照射（照射劑量為10.2J/cm2,UVB劑量劑量不得超過0.1J/cm2（試驗前用紫外輻照計在實驗動物頸背部照射區域測定光強度（mW/cm2）,計算照射時間），詳見圖1。去角質、開放涂布受試物、紫外照射的過程每天進行一次，共計進行5次。第6頁共12頁UVAA INDUCTION PHASE (A)B INDUCTION PHASE (B)圖1光誘導階段的佐劑注射、受試物涂敷及紫外線照射示意圖7.6.3 光激發階段的處理光誘導處理完成后兩周，將豚鼠背部脊柱兩側皮膚區域去毛，去毛區每塊面積約為2X2cm2,實際涂抹面積為

10、1.5X1.5cm2,共46塊去毛區（見圖2）。將動物固定，在動物去毛區3和4涂敷0.02ml（g）受試物（陽性對照組、陰性對照組則涂抹陽性物或陰性（溶劑）對照物）（涂抹區域見圖3）。如果受試物為化妝品產品，激發階段的最大涂敷量不超過0.2ml（g）。30min后，頸部去毛區和左側去毛區（1和3）用鋁箔覆蓋，無刺激性膠帶固定，右側去毛區（2和4）用UVA光源進行照射。受試物涂敷劑量濃度為經過預試驗得到的、允許進行恰當評價的濃度。光源為UV-A,照射劑量為10.2J/cm2。7.6.4 觀察與評分光激發階段紫外照射后的24h與48h,肉眼觀察涂抹部位的皮膚局部反應，并評分。記錄光誘導階段紫外照射

11、后的24h,肉眼觀察涂抹照射部位的皮膚局部反應，并評分。同時觀察動物的一般狀態、行為、體征等。必要時可對受試物給藥部位皮膚進行組織病理學檢查。根據表1對每只動物皮膚反應評分。7.6.5 結果評價（1）當受試物組動物出現皮膚反應積分2時，判為該動物出現皮膚光變態反應陽性。（2）光致敏率的計算方法為受試組動物皮膚光變態反應陽性的動物數/總動物數*100%。根據光致敏率對受試物的光變態反應進行強度分級（表2）。（3）光變態反應試驗成立的判定：每組動物數設定為5只條件下，陽性組動物中皮膚光變態反應陽性動物數1只，且陰性（溶劑）對照組全部動物中無皮膚光變態反應陽性動物，判定該光變態反應試驗系統成立；每組

12、動物數10只條件下，20%w陽性組致敏率w60%,且陰性對照組致敏率<10%時，判定該光變態反應試驗系統成立。（4）受試物光變態反應性的判定：每組動物數設定為5只條件下，受試物組動物中皮膚光變態反應陽性動物1只時，或每組動物數10只條件下，受試物組動物致敏率20%時，判定該受試物在該濃度下具有光變態反應性。（5）皮膚光變態反應試驗應根據比較對照組和受試物組的反應進行評價。陽性結果時應追加試驗，如：與已知陽性物質的比較試驗及用其他方法（不加佐劑）進行試驗，其中非損傷性試驗方法有利于進一步對光變態反應性進行評價。另外，光變態反應與光毒是兩類較難以僅從觀察結果進行區分的反應，必要時應追加光毒性

13、試驗。L'AB ELICITATION PHASE 圖2光激發階段受試物涂抹與紫外照射示意圖表1光變態反應試驗皮膚反應評分標準皮膚反應評分無反應0輕微的紅斑（勉強可見）1明顯紅斑（散在或小塊紅斑）2中毒-重度紅斑3嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4無水腫0輕微水腫（勉強可見）1中度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2嚴重水腫（皮膚隆起約1cm或以上）3最高積分7表2皮膚光變態反應試驗致敏強度分級*，#致敏率（）等級致敏強度010I弱1130II輕3160III中6180IV強81100V極強*:進行致敏強度分級時，每組動物數需增加到至少10只#:致敏率是反應評分為2或以上的動物數占該組動物總數的

14、百分比，I級致敏度(弱致敏度)沒有意義，在實際使用下無致敏危險。8試驗報告報告應包括如下內容：(1)受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；(2)實驗動物的種屬、品系、來源(注明合格證號和動物級別)、性別、數量；(3)實驗動物飼養環境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；(4)試驗方法；(5)試驗開始和結束時動物體重；(6)結果：以表格形式報告各組動物皮膚反應情況和致敏率等(建議的表格形式見表3);(7)結論。表3xxx對豚鼠皮膚光父態反應試驗結果（AdjuvantandStrip法）組誘導階段局部皮膚反應評分（誘導照射后24h）激發階段觀察局部皮膚反應評分（激發照射后）2致另

15、物時間的動敏數紅斑（只）水腫（只）（激紅斑（只）水腫（只）物數率發照（只（射）后，h)受試物紫外照012340123受試物紫外照射012340123劑量射劑量劑量劑量ml(g)J/cm2ml(g)J/cm2陰0.110.20.0210.224性對昭八、48組受0.110.20.0210.224試物48組陽0.110.20.0210.224性對昭八、48組&&:每組動物數為5只，陽性對照組皮膚反應強度得分2的動物數1只且陰性（溶劑）對照組全部動物中無皮膚光變態反應陽性動物時，或者每組動物數10只，20%w陽性組致敏率w60%,且陰性對照組致敏率<10%時，該試驗系統方能成立

16、。第7頁共12頁9試驗結果的解釋試驗結果應能得出受試物的光變態反應能力，必要時給出受試物的光致敏強度。動物試驗結果只能在很有限的范圍內外推到人類。引起豚鼠強烈反應的物質在人群中也可能引起一定程度的光變態反應，而引起豚鼠較弱反應的物質在人群中也許不能引起光變態反應。第 12 頁 共 12 頁“皮膚光變態反應試驗”起草說明1、 基本情況：光變態是IV型超敏反應的特殊類型，目前世界各國有關光變態試驗尚未形成統一的評價方法及操作規程，推薦的各種方法的敏感性差異較大，各有優缺點。ICH、歐盟（EMEA）和美國（FDA/CDER）在免疫毒性指導原則中均沒有具體的評價光敏潛在性的常規非臨床試驗方法。我國已經

17、發布的“化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則”和“天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應）研究的技術指導原則”中對光變態的評價基本上參考國外的評價方法。推薦采用AdjuvantandStrip（佐劑和角質剝離）法、Harber法、Horio法、Jordan法、Maurer法、Morikawa和Vinson法等。而化妝品安全性評價的標準、規范中尚未納入。為滿足化妝品行業發展的需要及化妝品安全監管的需要，有必要制定規范的皮膚光變態反應試驗方法作為化妝品安全性評價中用以補充化妝品原料及產品的光安全性檢測。2、 起草過程：本試驗方法以采標的方式進行撰寫編制，在起草過程中主要參照日本化妝品工業連

18、合會所編寫的化妝品安全性評價指南2015中“光感作性”章節、美國EPA1982年編寫的皮膚毒性一書中“光變態反應試驗”章節、以及我國食品藥品監管總局2015年5月13日所編寫的化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則。在皮膚光變態反應動物試驗方法的編寫中，有關“化妝品原料進行光安全性評價的基本原則”、“光變態反應的定義”、“光變態反應試驗的適用范圍”等內容主要參考歐洲藥品審評局（EMEA）2003年光安全性測試指南注釋、ICH。試驗動物的選擇參照THESCCSNOTESOFGUIDANCEFORTHETESTINGOFCOSMETICINGREDIENTSANDTHEIRSAFETYEV

19、ALUATION（9threvision,September29th,2015）。動物光變態試驗（佐劑加角質剝離法）的試驗條件與步驟主要依據日本化妝品工業連合會所編寫的化妝品安全性評價指南2015，美國EPA編寫的光變態反應試驗中相關章節、以及引用數較多兩篇核心的英文文章與1本專業書籍中相關章節。參照了ICH2015年1月最新修訂的藥物光安全性評估指導原則-S10-Step5以及歐洲藥品局（EMA）對該導則的解讀，從中主要參考目前光安全性評價的策略與原則，光變態反應試驗發展的現狀。同時主要參考4篇近期英文文獻中報道的體外光過敏檢測方法進展情況。3、 制定依據：本方法主要以日本化妝品工業連合會所

20、編寫的化妝品安全性評價指南2015中光變態反應試驗、EPA編寫的為指導原則，具體依據如下：【1】光感作性。化粒品G安全性言刊而仁H馬指金十2015(日本化粒品工H速合會編，2015年11月27日出版，蕖事日幸艮社)【2】PhotoallegyTesting.Dermototoxicity(USEPA,1982)【3】化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則。【H】GPT4-1。國家食品藥品監管總局。2015年5月13日【4】THESCCSNOTESOFGUIDANCEFORTHETESTINGOFCOSMETICINGREDIENTSANDTHEIRSAFETYEVALUATION(9t

21、hrevision,September29th,2015)【5】ICHGuidanceS10onPhotosafetyEvaluationofPharmaceuticalsStep5.ICH,January2015【6】中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光過敏反應)研究的技術指導原則。【Z】GPT5-1。國家食品藥品監管總局。2005年3月。【7】GuidanceforIndustry-PhotosafetyTesting.(CDERFDAUSDHHS,2003)4、 主要內容：本文主要從皮膚光變態試驗方法所適用的范圍、所引用的規范性文件試驗的原理、試驗基本原則及試驗所涉及的相關試驗、方法、步驟

22、等方面進行描述，主要從動物試驗、人體試驗兩方面，重點介紹了試驗所涉及的動物選擇與分組、陰性、陽性對照組的設置。同時分誘導階段與激發階段，較為細致具體地描述了試驗中受試物劑量設置、光源選擇、紫外照射水平的選擇等重要內容，并在試驗方法中對于動物備皮、佐劑注射、受試物給藥與紫外線照射的流程中各環節的實驗條件與操作方法進行了細致描述。5、 其他需要說明的問題目前雖然在制藥行業與工業方面均有光變態反應的動物試驗方法，但由于動物試驗結果對人體試驗預測性不理想、以及動物福利方面的考慮，美國FDA早在2003年即廢除了光變態反應的動物試驗方法，而EMA、ICH也已經將重點轉向體外替代方法。但動物試驗仍然是進行

23、人體光變態反應的前提之一，對特定具有光過敏性的藥品與化妝品原料的安全性評價仍具有一定意義。影響光變態反應試驗結果的因素較為復雜，除受試物本身理化特性外，試驗方案中受試物劑量的設置、紫外線照射劑量的設定、誘導階段與激發階段的具體方案、已經是否使用佐劑的選擇有可能影響最終的結果。“光變態反應試驗方法”編制說明為進一步完善化妝品安全技術法規體系，中國食品藥品檢定研究院組織開展了光變態反應試驗方法的制訂工作。1、 必要性（一）滿足化妝品行業發展的需要。近年來，我國化妝品生產和消費均呈現快速發展的趨勢。隨著化妝品行業的發展和科學認識的提高，原有的化妝品安全評價方法在某些方面上已不能完全滿足當前化妝品行業

24、發展需要，亟待進行補充修訂。光敏性物質是指善于吸收太陽光中的長波紫外線的物質。常見的有植物性香料、動物性香料以及染料、焦油、瀝青類物質等。日常生活中經常使用的膏霜類、香水類、香粉類化妝品中含有的香精、染發膏中含有的各種染料等就含有各種光敏性物質。在日光照射下，反復使用含有光敏物質的化妝品、化學品有可能引起光變態反應，產生丘疹、紅斑等皮膚損傷。鑒于免疫系統的復雜性、人與動物種屬間的差異以及相關檢測技術發展的局限性，目前還沒有行之有效的可以預測化學物質潛在致敏性的評價方法。豚鼠皮膚光變態反應試驗早在20世紀70年代就已經被引入到光敏性藥品的光安全評價方法中，日本化妝品工業聯合會一直也使用該方法進行化妝品原料的光安全性評價。人體光斑貼試驗目前主要用于藥品的光變態性檢驗中。目前國內缺乏對于具有光變態反應性的化妝品原料的檢驗方法。因此，將其納入到化妝品安全性評價方法中，可進一步補充化妝品原料及產品的光安全性評估方法。（二）滿足化妝品安全監管的需要。在化妝品行業迅速發展的同時，化妝品安全事件頻頻發生，公眾對化妝品的質量安全要求和監管期望越來越高。一些監督過程中必需的檢驗檢測及評價方法需要進一步明確。在我國，藥品等已將光變態反應試驗方