1、文件編號： S-YF-013 （ 01）型高效液相色譜儀測定川芎含量檢驗方法驗證方案文件編號S-YF-013 （01）起 草 人崔英南日期2012年 08月 26日審 核 人日期2012年 08月 31日批 準 人李立新日期2012年 08月 31日生效日期2012年 09月 01日第1頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）驗證項目申請單文件編號： SMP.QA-YG-001-01再確認項目用高效液相色譜儀測定川芎含量檢驗方法驗證對已進行設計、選型、安裝、運行及系統適應性測試設備確認的高效液相色譜儀， 通過選用生產品種 （藥典）川芎進行含量測定，驗證其檢驗方法準確度、精密度、專屬性

2、、線性、范圍、耐用性目的的正確性，證實該設備設計、 選型是否符合藥品質量標準中含量測定的要求，使檢驗指標具有可控性、科學性、準確性，使設備達到設計要求及規定的技術指標， 把好質量關，使合格產品能按 GMP 要求進行放行。組長：小組員：組成員要求完2012年 09月 09日成時間提出部門：質量保證部批準部門：再確認委員會簽字簽字年月日年月日備注第2頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）驗證題目目的概要再確認小組成員驗證方法期待結果驗證方式超過允許值的對應措施驗證實施時間小組負責人起草責任者審核責任者批準責任者驗證項目計劃書文件編號：SMP.QA-YG-001-02用高效液相色譜儀測定

3、川芎含量檢驗方法驗證對已進行設計、選型、安裝、運行及系統適應性測試設備確認的高效液相色譜儀，通過選用生產品種（藥典）川芎進行含量測定，驗證其檢驗方法準確度、精密度、專屬性、線性、范圍、耐用性的正確性，證實該設備設計、選型是否符合藥品質量標準中含量測定的要求，使檢驗指標具有可控性、科學性、準確性，使設備達到設計要求及規定的技術指標，把好質量關，使合格產品能按GMP 要求進行放行。組長：組員：用高效液相色譜儀測定含量檢驗用已確認的設備對生產品種進行含量測定，驗證檢驗方法的準確度、精密性等符合生產、質量、 GMP 的規定，符合該設備的設計、選型能夠滿足檢驗要求，所采用的方法達到相應的檢測要求，達到測

4、得指標的科學、準確性，已滿足控制產品質量的需要。同步驗證1. 待系統穩定后，重新檢測。2. 必要時，對有關設備重新處理和調整后，再測試，分析檢測結果以確定不合格原因。3. 若屬于設備運行方面的原因，必要時報再確認委員會，調整設備運行參數。2012年 09月 01日2012年 08月 31日起草時間2012年 08月 26日審核時間2012年 08月 31日批準時間2012年 08月 31日第3頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）驗證方案審批表吉SMP.QA-YG-001-03再確認方案名稱用高效液相色譜儀測定川芎含量檢驗方法驗證再確認方案編號S-YF-013（01）起草人崔英南2

5、012年08月 26日所在部門簽字審核意見日期質量管理部年月日生產技術部年月日設備動力部年月日飲片車間年月日供銷部年月日化驗室年月日審年月日核年月日人年月日年月日年月日年月日年月日批準 人日 期年月日批準意見同意執行日期年月日第4頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）目錄1 再確認目的2 再確認范圍3 再確認責任4 內容4.1概述4.2 再確認內容再確認小組預確認安裝確認運行確認性能確認結果分析與評價4.2.7再確認周期第5頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）文件名稱用高效液相色譜儀測定川芎含量檢驗方法驗證文件編號S-YF-013-（01）起 草 人崔英南起草日期20

6、12年 08 月 26日審 核 人審核日期年月日批 準 人批準日期年月日執行日期年月日頒發部門質量管理部版 本 號01分發號分發部門質管化驗生產車間辦公財務 供銷設備分發數量21110011目的確認經設備確認高效液相，按藥典檢驗方法測定生產品種含量，驗證其檢驗結果科學性、準確性、精密性等，滿足檢驗結果正確性需要，有效控制產品質量。提供必要的文件以證實本設備的操作與所預期的完全一致。根據本方案的驗證，確認按檢驗操作規程操作，能有效的保持本設備于確認狀態下，能穩定地、恒定地達成其所預期的功能。范圍質量標準、檢驗操作規程文件的匯集。驗證設備用于含量測定檢驗方法的準確性在標準范圍內驗證設備用于含量測定

7、檢驗方法的精密度可靠性驗證設備用于含量測定檢驗方法，在設計的范圍內，測試結果與供試品中被測物嘗試直接呈正比關系的程度。驗證設備用于含量測定檢驗方法具有專屬性。驗證設備用于含量測定檢驗方法在達到一定精密度、準確度和線性時，其測定值高低限在可控范圍內。驗證設備用于含量測定檢驗方法的耐用性。第6頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）責任質量管理部負責驗證方案的起草，申請審批，驗證過程的監督、資料的存檔，再確認方案的執行及再確認結果的評估。化驗室負責實驗的操作，原始記錄、報告的填寫。驗證小組負責驗證報告的審核。內容1 概述：本設備由 P3000高壓輸液泵和 UV3000 可變波長紫外 /可

8、見分光檢測器組成。P3000 高壓輸液泵是以CPLD 技術為核心，由單片機控制的高精密輸液泵系統。它基于全數字的頻率發生系統、先進的馬達驅動系統及友好的人機顯示頁面似的該設備的操作及控制很方便。先進的泵頭及單項閥設計思路，融匯了當今世界上最先進的經驗，使得用戶在各種使用條件下都可以保證輸液的精度及重復性指標。UV3000 紫外 /可見波長檢測器是完整的高效液相色譜儀的一個重要的組成部分。該檢測器的設計以當今最先進的技術為先導，通過數字化的數據處理和控制，其基線噪聲和漂移降低到一個新的極限。由于采用了數字量輸出功能，該檢測器可以與計算機直接通過串行口相連而不需要任何數據采集單元。該設備已經設計、

9、安裝、運行、性能確認，并經過計量校驗，在有效期范圍內。通過該設備用于生產品種川芎中阿魏酸的含量測定，驗證該設備的準確性、精密性、專屬性、線性、范圍、及耐用性是否符合要求。2 驗證內容2.1 驗證小組：由廠驗證領導小組安排，成立P3000/U3000 高效液相色譜儀驗證小組。組長： 張杰組員：小組職務姓名所在部門職務第7頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）組員設備動力部設備管理員組員化驗室主任組員質量管理部質量監督員組員化驗室化驗員2.2預確認2.2.1 設備基本情況2.2.1.1 設備制造商及零件供應商資料設備名稱：高效液相色譜儀編號： 021型號：制造商：地址：電話：傳真：聯絡

10、人：2.2.2 設備的檔案資料文件名稱存放地點高效液相色譜儀質量管理部一份產品保修單質量管理部一份使用證明書質量管理部一份合格證質量管理部一份設備開箱驗收單質量管理部一份設備安裝調試驗收單質量管理部一份色譜工作站質量管理部一份綜合性評價結果上述設備檔案材料符合GMP 和生產工藝要求。檢查人檢查日期年月日復核人復核日期年月日第8頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）2.3 該設備是否滿足GMP 及現行生產工藝要求的確認檢查并確認設備組成的單體結構應完整，并且各單體結構外觀應無缺陷性損壞。設備單體結構名稱有無缺陷損壞可變波長紫外 /可見分光檢測器無缺陷損壞高壓輸液泵無缺陷損壞綜合 性設

11、備組成的單體結構完整，并且各單體結構外觀無缺陷性評價結果損壞。檢查人檢查日期年月日復核人復核日期年月日檢查設備所有材質制造應符合生產工藝要求單體設備名稱要求材質實際材質可變波長紫外 /可見分光檢測器不與藥物發生化學反應不銹鋼高壓輸液泵不與藥物發生化學反應不銹鋼綜合性評設備所有材質制造不與藥物發生化學反應，符合藥價結果品檢驗要求。檢查人檢查日期年月日復核人復核日期年月日2.4 設備確認該設備已經設備的設計、安裝、運行、性能再確認，同時該設備經計量校驗確認，并在有效期范圍內。2.5 人員、環境、試藥的確認化驗員已經均經過培訓，熟悉方法及使用的儀器，環境濕度為56%，溫度為 20均在合理范圍內。對照

12、品從國家生物檢定研究院購置，批號為有效期為其它試劑為色譜純，水為純化水均符合試驗要求。3 含量測定第9頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）3.1 準確度驗證準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（ %）表示，準確度應在規定的范圍內測試。色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 -1%醋酸溶液（ 30：70）為流動相；檢測波長為321nm。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4000。流速： 1.0ml/min ；色譜柱規格：4.6 × 250mm；粒度： 5m；進樣量： 10l 。對照品溶液的制備取阿魏酸對照品適量，精密稱定

13、，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每 1ml 含 20g 的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 50ml，密塞，稱定重量，加熱回流 30 分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得。測定法可用上述已知純度的對照品做加樣回收測定，即于已知被測成分對照品，在規定范圍內，取同一濃度的供試品進行測定。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10l ，注入液相色譜儀，測定。同一濃度，用 6 個測定結果進行評價， 應報告已知加入量的回收率 （%），或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準

14、偏差（RSD%）。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。公式：回收率 %=（C-A ）/B*100%式中 A 為供試品所含被測成分量；B 為加入對照量；C 為實測值。第10頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）實測值公式：平均值 X= Xi/n平均偏差 = Xi-X /n平均相對偏差 =平均偏差 /平均值附圖：樣品與對照品峰面積見圖譜。加樣回收率考察取本品粉末 6 份，精密稱定，按照供試品方法制備，得到供試品溶液各 50ml，各加入 10ml 對照品溶液，搖勻，得到待測溶液，濾過，進樣，計算峰面積，得到數據如下表：注意：在加樣回收試驗中須注意對照品的加入量與供試

15、品中被測成分含有量之和必須在標準曲線性范圍之內；加入的對照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。表 1 含量測定川芎加樣回收率試驗表序樣品稱量樣品阿魏酸對照品實測值回收率回收率的RSD（%）加入量平均值號（g）的含量（mg）（mg）（ %）（mg）（）10.50140.55150.20.7534100.9520.52260.67940.20.878699.6030.51730.62080.20.819399.25100.080.891340.52660.63190.20.8348101.4550.53250.69230.20.889799.7060.5148

16、0.61780.20.816999.55檢測人：檢測日期：第11頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）結果評價：檢查人：復核人：日期：年月日3.2 精密度驗證精密度系指在規定的測試條件下，同一個均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差，標準偏差或相對標準偏差表示。同一濃度，用6 個測定結果進行評價。精密度包含重復性，中間精密度和重現性，其中重現性是在不同化驗室不同時間進行實驗，查看實驗結果有沒有重現性，本公司只一個實驗室此項略。重復性（設操作人員A）在相同操作條件下，由同一個分析人員在較短的間隔時間內測定所得結果的精密度稱為重復性；色譜條件與系統適用性試驗

17、以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 -1%醋酸溶液（ 30：70）為流動相；檢測波長為321nm。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4000。流速：1.0ml/min；色譜柱規格：4.6×250mm；粒度： 5m；進樣量： 10l。對照品溶液的制備取阿魏酸對照品適量， 精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每 1ml 含 20g 的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 70%甲醇 50ml ，密塞，稱定重量，加熱回流 30 分鐘，放冷，再稱定重量，用 70%甲醇補足減失的重量，第12頁共22頁文件編號： S-YF-013

18、 （ 01）搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得。含量測定計算A Tn TA T25含量 (m g / g )ffWWTT式中 f 為對照品的濃度除以對照品峰面積得到的值的平均值；AT 為對照品峰面積；單位v*sec；n為供試品的稀釋倍數；WT 為供試品的稱量；單位g。將計算的結果填入下表表 2含量測定阿魏酸重復性試驗表序號樣品稱量（g） 含量（ g/g ）含量的平均值（ g/g ）RSD（%）10.50140.1020.52260.1330.51730.120.121670.619140.52660.1250.53250.1360.51480.12檢測人：檢測日期：結果評價：檢查人：復

19、核人：日期：年月日中間精密度（換一時間，換一操作人員，設操作人員為B）第13頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度稱為中間精密度；同一濃度，用6 個測定結果進行評價。色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 -1%醋酸溶液（ 30：70）為流動相；檢測波長為321nm。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4000。流速：1.0ml/min；色譜柱規格：4.6×250mm；粒度： 5m；進樣量： 10l。對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量， 精密稱定，置棕色量瓶中，加 70%甲醇制成每 1

20、ml 含 20g 的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 50ml ，密塞，稱定重量，加熱回流30 分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得。含量測定計算公式：ATnTAT 25含量 (m g / g )fW TfW T式中 f 為對照品的濃度除以對照品峰面積得到的值的平均值；AT 為對照品峰面積；單位v*sec；n為供試品的稀釋倍數；WT 為供試品的稱量；單位g。第14頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）表 3： 含量測定阿魏酸甲中間精密度試驗表序號樣品

21、稱量（g） 含量（ g/g ） 含量的平均值（ g/g） RSD（ %）10.50140.119820.50140.120330.50140.11960.12000.0074操作員 A0.50140.1211450.50140.118660.50140.120710.51730.120620.51730.12590.12510.025530.51730.1237操作員 B0.51730.1301450.51730.123860.51730.1263檢測人：檢測日期：結果評價：檢查人：復核人：日期：年月日3.3 線性及線性范圍線性系指在設計的范圍內，測試結果與供試品中被測物嘗試直接呈正比關系的程

22、度。應在規定的范圍內測定線性關系。可用一貯備液經精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試品的方法進行測定，至少制備5 個濃度的供應品，以測得的響應信號作為被測物嘗試的函數作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經數學轉換，第15頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）再進行線性回歸計算。數據要求：應列出回歸方程，相關系數和線性圖。范圍系指能達到一定精密度、準確度和線性、測試方法適用的高低限嘗試或量的區間。范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果及要求確定。色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 -1%醋酸溶液（ 30：

23、70）為流動相；檢測波長為321nm。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4000。流速：1.0ml/min；色譜柱規格：4.6×250mm；粒度： 5m；進樣量： 10l。對照品溶液的制備取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每 1ml 含 20g 的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 50ml，密塞，稱定重量，加熱回流 30 分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得。含量測定計算公式：A Tn TA T25含量 (m g / g )ffW

24、TWT式中 f 為對照品的濃度除以對照品峰面積得到的值的平均值；第16頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）AT 為對照品峰面積；單位v*sec；n為供試品的稀釋倍數；WT 為供試品的稱量；單位g。表 4川芎阿魏酸不同濃度的峰面積濃度（ mg/ml）0.0050.010.030.050.07峰面積（v*sec）回歸方程y=29433200x相關系數R2=0.9999檢測人：檢測日期：結果評價：檢查人：復核人：日期：年月日3.4 耐用性耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為使方法用于常規檢驗提供依據。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。液相色譜法中典型的變

25、動因素有：不同廠牌或批號的色譜柱、固定相，不同類型的擔體，柱溫，進樣口和檢測器溫度等。經試驗，應說明小的變動能否通過設計的系統適用性試驗，以確保方法有效。第17頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）本試驗以流動相的組成比例、同一規格的色譜柱為變動因素，得出測定結果不受影響的程度，為使方法用于常規檢驗提供依據。對照品溶液的制備取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每 1ml 含 20g 的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約0. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 50ml，密塞，稱定重量，加熱回流 30 分鐘，放冷，再稱定重量，

26、用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得。色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 1、以甲醇 -1%醋酸溶液（ 30：70）為流動相；檢測波長為321nm。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4000。流速：1.0ml/min；色譜柱規格：4.6×250mm；粒度： 5m；進樣量： 10l。2、以甲醇 -1%醋酸溶液（ 35：65）為流動相；檢測波長為321nm。色譜柱規格： 4.6×250mm；粒度： 5m；進樣量： 10l。測定將數據整理，填入下表。表 4 含量測定耐用性試驗表保留時間分離度理論板數色譜條件 1色譜條件 2檢測人

27、：檢測日期：結果評價：第18頁共22頁文件編號： S-YF-013 （ 01）檢查人：復核人：日期：年月日3.5 專屬性專屬性是指在其他成分可能存在下，采用的方法能正確測定出被測的特性，以不含被測成分的供試品（除去含待測成分藥材或不含待測成分的模擬復方）試驗說明方法的專屬性。色譜法，光譜法等應附代表性圖譜，并標明相關成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應符合要求。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測，進行峰純度檢查。色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 -1%醋酸溶液（ 30：70）為流動相；檢測波長為321nm。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4000。流速：1.0ml/min；色譜柱規格：4.6