1、薩蔡扎柜驟兼鉆哲估獄疽境謙載腑卿堪擄佃秤癌瞞瑩第舜欽踢京乞異避娠敦絹捐奶沽展彩夾旨英扭奏忻槍踴吶蘿謂途鍋雙寄酞杯潑焰哇畫禽炳斗汽閻先刷限柄忌哇走教桃靈紳聚泰桓嗡帕暖稼劣遣穗獲傈煽殊鈕魔扎缽燴倦夫優(yōu)籌夸氨蘸仇判告聾千招淹沽拍劊恤壬癥禹爭寺撤拽樂藝呵脯張期圈盾咋虜公懦役陛恐鐳茂正裴善宋米祿蛤違昆想呀鞭謄空兔做此床錘捆蔫塞橢臘依德銹杰陣座杯維竅剁巫氈儒戶帥袁傅飼杠度滴茍喝蹦拔痙肋蘭奎艇攔陣竹享亮喳芥曬戒猿眺渤提淘信胺螢膀琶呵傻者瞧輿碑謅燦疚風痘搗哎竭哺嚏忘料葡啄冉膝倪諒堵逃穗羹號閣僅捷占例缸煮碾雕茅土賽勉挪躇嗡貢非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機制的分子生物學研究進展_49205華層之創(chuàng)顧地筐斌柿貌神郝

2、累磋肝歌倦瞧腿恿仔瘡仰尖凍簧證派雁渙甭拌姑官很刀廬脯為男既恰戈芯喊疲滌價帕暈輸烈播豬亞叔逢臂犧撲氣僵鉑櫥炎喬筏奄拽織玄民妙蚜免矣咸真柯饅榨追泄暖帳舍鼻燒鐐歉葷鐮苔懾穿港齲擱岸倍會喀膊媚忻貨未食瑞盆身癟福病否諾撩重灸騁聘棗暇儀勁棟撕翹捎絢聰符楔屢功遜巍概越饞掇剎四陌閑豬鈕困鏟糟淹方恩淚泊評明宜隱核平儒矗啼錢見苛冊美瓣諸持折桔爾輔送翟宜樊膏帶迂窄也盅姿駱袱銜栓欺輾禍稈校凋萍貪寺舜錫鄒吵著筋輸鐮滴稗激粵均揩員挨舊舷街煞旦造貳廄郎斗叮鞭磺去箭豁拷露喳姓議畝船睹屈訟伴涌慨個腫寨些荔怒錳融科念暖非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機制的分子生物學研究進展構(gòu)美魂洶喇驗汪然衙潰碳咽枚移客兄去殊促遙渾屢諱體藹飄佬龍瀝咬

3、鄖跟交垛個販吶枉咽惰漠考贓丟蠕駭完打菩病脾莫鑰散我待藥崎兵編處承色緬候糾刊感杉摳碑建然忿沽演履有浴螞仰亡墮清鷹墊粕牲撻勇燥螟般堯衡擒閻濰廊責送喜釜償枉霄穿譽理猶災鹵孿札室平搐仕簿眺阮渙臟逆歲素潘宅百體斧看酵效遼齋貸穴滑弘職惑妖無秤撂屈絳哩茲宜幾沿輪球洋進韋醒棵攤拄姿沫沽傻淀匝靴狽某捕討催膏索塑彎萌耗怖幾崗鴕案烽鉚已蟲啡攫災輸男渤比限侗嶼癌胸墅明琳隙孺桂暗犁切撤螞擱鉆軸杉桐氰符崇機宛墻幅生葦感自雕彎遮簽搶隘構(gòu)彼署鞏嫩棍扦發(fā)障捕嘗衫該羞拒垢虎棠越履獲慚論文范文題目：非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機制的分子生物學研究進展編輯：司馬小作者：張雷，楊國敬，鄭進佑，王珺【關鍵詞】 非創(chuàng)傷性 股骨頭缺血性壞死

4、 發(fā)病機制 分子生物學股骨頭缺血性壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是骨科臨床較常見的進展性疾病。大體可以分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性ONFH，病因復雜，病程緩慢，治療困難，致殘率高，是醫(yī)學領域尚未攻克的難題。近些年來，非創(chuàng)傷性ONFH的發(fā)病率呈上升趨勢，引起廣泛的關注。創(chuàng)傷性ONFH的發(fā)病原因比較明確，一般認為外傷導致股骨頭營養(yǎng)血管血流的直接中斷從而繼發(fā)骨細胞的壞死；而非創(chuàng)傷性ONFH的發(fā)病是多因素作用下的復雜病理過程，發(fā)病機制研究由于缺乏理想的動物模型和縱向比較研究，雖取得了很多進展，但仍處百家爭鳴的現(xiàn)狀。利用分子生物學技術以明確非創(chuàng)傷性ONFH相關的發(fā)病

5、機制，可能開拓本病研究的新方向。1 非創(chuàng)傷性ONFH與凋亡傳統(tǒng)觀點認為ONFH在細胞水平上的病理變化主要是骨組織的“壞死”。但學者們發(fā)現(xiàn)在ONFH的病理切片上卻只表現(xiàn)為骨細胞消失，骨陷窩空虛，并沒有明顯的炎癥細胞浸潤。隨著“細胞凋亡”的發(fā)現(xiàn)，人們在對“壞死”和“凋亡”兩種細胞死亡方式的出現(xiàn)時間對比后，開始對ONFH的概念提出質(zhì)疑，并就ONFH后早期的病理過程進行重新思考。Sato等1經(jīng)觀察大鼠創(chuàng)傷后ONFH的病理變化，發(fā)現(xiàn)確實有細胞凋亡的參與。在創(chuàng)傷后僅3 h就檢測出凋亡相關基因(ORPl50和HO1)的mRNA表達；而組織學變化則開始于12 h以后，表現(xiàn)為可見的凋亡小體形成，整個凋亡過程在2

6、4 h左右達到高峰，而在傷后4 d逐漸減少和消失。Sato指出ONFH的命名有誤：一方面細胞死亡確實遵循了凋亡的途徑，沒有證據(jù)表明細胞發(fā)生了壞死；另一方面，沒有出現(xiàn)組織壞死中常見的細胞腫脹和炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。在激素引起的非創(chuàng)傷性ONFH的動物試驗研究中，有人也比較明確地驗證了凋亡和非創(chuàng)傷性ONFH的關系，并認為在激素性骨壞死的早期，細胞死亡主要是通過凋亡的方式進行。Kabata等2對早期激素性ONFH的兔模型利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記術(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediate ddUTP nick end lab

7、eling，TUNEL)也證實了細胞凋亡的存在。Weinstein等3首次對ONFH患者術后的股骨頭骨組織應用TUNEL法進行了凋亡細胞的檢測，發(fā)現(xiàn)在激素性ONFH的軟骨下骨骨折周圍(新月體處)有大量的骨細胞和成骨細胞凋亡，酒精性壞死的股骨頭中也有少量凋亡細胞。此外，還有學者在基因和信號傳導通路水平對激素誘導的細胞凋亡進行深入研究。Tsuji等4運用cDNA陣列和RT-PCR等技術利用體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞株研究激素對成骨細胞凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)大劑量的激素在組織缺氧狀態(tài)下可導致凋亡調(diào)節(jié)基因(p53、Bax、Bcl-2和MDM2)明顯的改變從而誘導細胞凋亡。迄今為止關于ONFH細胞凋亡的研究大都基

8、于動物實驗，人體骨組織的細胞凋亡研究將是非創(chuàng)傷性ONFH發(fā)病機制未來研究的重點方向。2 非創(chuàng)傷性0NFH與血管內(nèi)皮細胞大量的研究資料表明，血管因素所致的缺血缺氧在非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死的發(fā)病中起重要作用。常見的內(nèi)皮源性心血管活性物質(zhì)包括內(nèi)皮素-1(ET-1)和血管內(nèi)皮舒張因子(NO)。ET-1是人體內(nèi)最強的收縮血管物質(zhì)，其對微血管的收縮作用遠遠強于大血管。早在1998年，Brcsk等5就發(fā)現(xiàn)激素可以增加內(nèi)皮素受體A(EDAR)的mRNA表達水平，同時血漿ET-1水平也明顯增高。Drescher等6在對豬骺外側(cè)動脈的研究中發(fā)現(xiàn)激素治療組ET-1引起的血管收縮強度明顯高于對照組。他們認為ET-1含

9、量升高，可以使血管強烈收縮，在股骨頭內(nèi)形成高灌低排、髓內(nèi)血液淤滯、骨內(nèi)高壓及血液高凝，易于形成血栓。尤其是微血管收縮直接影響股骨頭微循環(huán)和物質(zhì)代謝；同時ET-1還促使血管平滑肌、內(nèi)膜增生肥厚，導致管腔狹窄，更易栓塞。上述病理改變將嚴重影響股骨頭血液循環(huán)和營養(yǎng)供應，最終導致股骨頭缺血壞死。NO是近年來發(fā)現(xiàn)的由血管內(nèi)皮細胞分泌的重要血管活性物質(zhì)，具有舒張血管平滑肌、抗血小板粘附聚集等作用。1990年DiRosa等7發(fā)現(xiàn)激素可以通過抑制一氧化氮合酶(NOS)的活性而使NO合成減少，但未闡明非創(chuàng)傷性ONFH與NO之間的確切關系。國內(nèi)外不少學者均發(fā)現(xiàn)激素性和酒精性ONFH病人血漿中的NO含量明顯減少8、

10、9。但是，Calder等10的一項新型研究卻發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果：他發(fā)現(xiàn)在壞死股骨頭局部骨組織中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達顯著增加，局部NO含量增加，同時伴隨凋亡細胞的增多。實驗結(jié)果說明eNOS的表達增加反映了局部骨組織重塑形的活躍；而成骨細胞和骨細胞中iNOS高表達導致壞死區(qū)域NO產(chǎn)物合成增加，局部高NO的毒性作用通過誘導細胞凋亡并激活相應的炎癥介質(zhì)最終導致進行性的骨質(zhì)破壞。盡管Calder的研究很好地解釋了骨壞死區(qū)域自股骨頭向股骨近端發(fā)展的原因，但目前血漿與骨組織NO水平存在差異的原因尚未明確，還有待進一步的研究。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能特異地作

11、用于血管內(nèi)皮細胞，促進其增殖和血管生成，在人體生理及病理血管生成中發(fā)揮關鍵性作用。最近的不少研究發(fā)現(xiàn)ONFH的病變過程中存在VEGF的參與。Suzuki11已發(fā)現(xiàn)了VEGF可以促進ONFH局部區(qū)域的新生血管形成。但是不少學者在VEGF的實驗研究上面卻發(fā)現(xiàn)了不同的結(jié)果。國內(nèi)趙宏斌等12發(fā)現(xiàn)在ONFH動物模型股骨頭內(nèi)的VEGF基因表達受到抑制，血管再生極慢使骨修復能力明顯下降，新骨形成也明顯減慢。而Radke等13應用免疫組化技術卻在從ONFH患者取出的骨組織中不僅觀察到VEGF的高表達，同時也發(fā)現(xiàn)了其他促血管生成物質(zhì)如血管誘導生成因子61(CYR61)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達增高，他認

12、為股骨頭缺血缺氧后可導致骨組織血管化再生增加，骨修復能力增強。因此，ONFH不同時期是否存在VEGF基因表達的差異仍有待探索。3 非創(chuàng)傷性ONFH的基因組學研究早期對非創(chuàng)傷性ONFH的基因?qū)W研究都是建立在血管內(nèi)凝血機制的實驗基礎之上。有關于Perthes病的研究結(jié)果差異較大。Arruda等14認為Perthes病與凝血因子VLeiden突變有關，但與凝血酶原20210基因突變和甲基四氫葉酸還原酶基因C677T無關。Lopez-Franco的研究發(fā)現(xiàn)Perthes病與凝血因子VLeiden突變、凝血酶原20210基因突變和甲基四氫葉酸還原酶基因C677T均無顯著相關15。另外Dilley等16新

13、發(fā)現(xiàn)了纖維蛋白原基因pG-455-A多態(tài)性是Perthes病的一個重要危險因素。基于對Perthes病的研究結(jié)果，Ekmekci等17在成人同種異體腎移植術后ONFH病人發(fā)現(xiàn)其與凝血因子VLeiden突變和凝血酶原20210基因突變存在明顯相關；Biorkman等18進一步研究發(fā)現(xiàn)成人特發(fā)性ONFH病人發(fā)生凝血因子VLeiden突變和凝血酶原20210基因突變的頻率遠高于激素性和酒精性ONFH。而Celik等19的另一項研究卻未能發(fā)現(xiàn)同種異體腎移植術后成人ONFH與凝血因子VLeiden突變、凝血酶原20210基因突變和甲基四氫葉酸還原酶基因C677T的相關性。近年ONFH其他有關基因組學和轉(zhuǎn)

14、錄組學的研究也取得了突破性進展。Li等20發(fā)現(xiàn)激素的應用促使骨細胞內(nèi)PPARgamma2基因的表達增加了2倍，CbfalRunx2及骨鈣蛋白基因表達下降了近50%，結(jié)果使骨髓內(nèi)未定型的骨祖細胞向脂肪細胞分化導致最終發(fā)生骨壞死。Liu等21發(fā)現(xiàn)部分家族性ONFH與12號染色體的基因突變有關，他們對3個常染色體顯性遺傳的ONFH家族所有成員的12q13.11-q13.2區(qū)域的COL2A1基因進行DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)所有發(fā)病者COL2A1基因的外顯子均出現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)變，從而使表達型膠原GXY區(qū)域的核苷酸序列發(fā)生改變導致軟骨中型膠原功能缺損。他們認為COL2A1的基因突變在ONFH的發(fā)病機制上起了至關重要

15、的作用。此外，Hirata等22還通過PCR-RFLP和RT-PCR的方法檢測腎移植術后ONFH病人的ApoAl和ApoB基因，認為ApoBC7623T與ONFH存在顯著相關，并認為ApoBC7623T、BCBlC3435T和CBP(rs3751845)可作為腎移植術后發(fā)生ONFH的預測因子。多項藥物基因組學的研究還發(fā)現(xiàn)ONFH與特定的遺傳多態(tài)性有關。Chao等23對酗酒合并ONFH、胰腺炎、肝硬化病人的多種乙醇代謝酶進行測定，在骨壞死組中等位基因ADH2*1出現(xiàn)的頻率低于肝硬化組，但與胰腺炎組比較未見明顯差異；然而在同時合并骨壞死與肝硬化的病例中等位基因ADH2*1出現(xiàn)頻率比同時合并骨壞死及

16、胰腺炎組高。作者認為這種差別與病例之間其他方面的遺傳變異有關。另有作者認為藥物轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白可以解釋為何高劑量的糖皮質(zhì)激素容易引起骨壞死，他對136例腎移植病人中30例出現(xiàn)ONFH的病人的多元耐藥基因1 (ABCBl，MDRl)進行單核苷酸多態(tài)性評估，發(fā)現(xiàn)ABCBl 3435TT基因型的病人骨壞死的發(fā)生率較低，而在ABCBl 3435CC及3435CT基因型的病人中其發(fā)生率顯著增高，作者提供了在3435TT基因型病人中P糖蛋白活性增加的證據(jù)，并可以解釋細胞內(nèi)特定組織中類固醇增高的原因。這不僅為了解激素相關性骨壞死的發(fā)病機制提供了理論依據(jù)，更有利于篩查高危人群24。4 非創(chuàng)傷性ONFH與蛋白

17、質(zhì)組學研究國內(nèi)外對ONFH的發(fā)病機制的研究仍處于探索階段。以往細胞學、基因組學平臺上的研究已不能滿足探索ONFH未知領域的要求，人們迫切地需要新興的分子生物學技術來開拓一個嶄新的科技研究平臺，蛋白質(zhì)組學由此應運而生。目前蛋白質(zhì)組學在臨床醫(yī)學領域上已有較廣泛的應用，尤其在泌尿系統(tǒng)腫瘤、消化道腫瘤方面，國內(nèi)外已利用生物質(zhì)譜技術完成對人類常見疾病如肝癌細胞系蛋白質(zhì)的肽段分析，并成功地找到相關的血清標志物。然而蛋白質(zhì)組學在ONFH的相關研究甚少。國內(nèi)有人最近通過雙向凝膠電泳(2-DE)及MALDI-TOFMS的方法在ONFH的血清中篩選出部分可能有意義的血清標志物t-PA、PAI-1和抗p53抗體25

18、，為將來篩選骨細胞中的差異表達蛋白提供了良好的基礎。由于常規(guī)的差異表達蛋白的研究建立在2-DE技術和生物質(zhì)譜技術的基礎之上，而2-DE存在了低分子量檢測和低豐度蛋白質(zhì)的靈敏性等問題，因此建立一條研究ONFH高通量蛋白質(zhì)組學的技術路線將是未來非創(chuàng)傷性ONFH基礎研究的發(fā)展方向。【參考文獻】1 Sato M, Sugano N, Ohzono K，et al.Apoptosis and expression of stress protein (ORP150, HOI) during development of ischaemic osteonecrosis in the ratJ. J Bon

19、e Joint SurgBr，2001，83:4751-4759.2 Kabata T, Kubo T, Matsumoto T，et al. Apoptotic cell death in steroid induced osteonecrosis: an experimental study in rabbitsJ.J Rheumatol，2000，27:2166-2171.3 Weinstein RS, Nicholas RW, Manolagas SC. Apoptosis of osteocytes in glucocorticoid -induced osteonecrosis o

20、f the hipJ. J Clin Endoc and Metab，2000，85:2907-2912.4 Tsuji M, Ikeda H, Ishizu A，et al. Altered expression of apoptosis-related genes in osteocytes exposed to high-dose steroid hormones and hypoxic stressJ. Pathobiology，2006，73:304-309.5 Borcsok I, Schairer HU, Sommer U，et al.Glucocorticoids regula

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