1、老年性癡呆動物模型的研究進展         11-03-09 13:25:00     作者：凌雁武，黃瑞雅    編輯：studa20【關鍵詞】  老年性癡呆；動物模型 老年性癡呆又稱阿耳茨海默病（Alzheimer's disease，AD），是一種嚴重危害中老年人身心健康的神經系統退行性疾病，其臨床表現為進行性記憶力減退和智力下降，主要神經病理特征是大腦皮質萎縮、神經細胞喪失，細胞外存在大量由淀粉樣蛋

2、白（amyloid；A）組成的老年斑（Senile  Plaques；SP）、神經細胞內神經纖維絲纏結（Neurofibrillary tangles；NFTs）以及皮質動脈和小動脈的血管淀粉樣變性。因AD病因病理的多樣性、異質性和復雜性使建立理想的AD動物模型面臨巨大的困難和挑戰，但近年AD研究者采用各種方法開展AD模型的研制與應用，取得了一定成果，特別是AD轉基因動物模型應用成就更是令人矚目，本文就AD模型作一綜述。衰老動物模型    自然衰老鼠的形態學觀察可見鼠腦隔區、斜角帶核及Meynert基底核中的神經元萎縮、喪失，同時表現有感覺、運動及學習記

3、憶等多種功能的下降，這些改變與人類AD有相似之處。自Takeda T首次報道快速老化小鼠（Senescence  accelerated  mouse/prone,SAMP）后，快速老化小鼠作為一個較理想的衰老模型目前已在許多國家廣泛應用，其中SAMP8(prone/8)亞系既有自然衰老小鼠的特征，又有類似老年性癡呆的腦部病理及學習記憶功能衰退。與AD相關基因如載脂蛋白E,糖皮質激素a受體及鹽皮質受體mRNAs水平在SAMP8海馬中較SAMR1（快速老化小鼠的另一亞系）海馬明顯降低，而bcl2a,PS2和tau mRNA水平卻有顯著意義的增高。這些結果表明在AD病人腦中一些

4、異常基因表達也在SAMP8中存在。在AD病人中發現胰島素腦脊液/血漿比率降低曾被認為是腦糖代謝紊亂的機制，而通過對SAMP8研究證實，腦血管屏障完整性或對胰島素轉運能力的變化并非SAMP8鼠學習和記憶下降的基礎。KumarVB等1研究小組證實，反義磷酸硫解酶低聚核苷酸（AO）能夠降低SAMP8腦內自然過表達的APP及逆轉其學習及記憶的下降。SAMP8成功培育后，逐漸在眾多AD模型中占據重要地位，在國外已被廣泛應用于闡明學習記憶功能及學習記憶功能障礙的基本機制,評價干預老化關聯的疾病和改善學習記憶機能藥物，但國內因SAMP8鼠來源多有不便，相關研究開展較少。單因素損傷致AD動物模型 &

5、#160;  早期主要用化學物質如大田軟海綿酸（okadaic acid）、AlCl3、海人藻酸（kainic acid）以及淀粉樣蛋白等進行腦室或核團內注射，使之出現AD的病理典型表現（NFTs及SP）和學習功能障礙，大致可分為兩類：    1.與tau蛋白過度磷酸化有關的損傷模型 Okadaic acid (OA)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶(1A和2A)的特異性抑制劑。Nelson等2將OA注入成齡綿羊大腦，3月后在注射部位及其周圍呈現神經細胞內神經纖維絲纏結（NFT），OA大鼠側腦室注射6周后免疫組化分析可見NFT樣磷酸化Tau蛋白

6、和A淀粉樣沉積斑塊，而長期腦室投遞可引起動物的記憶嚴重缺失。OA誘導的神經退行性變性和tao 蛋白的磷酸化及氧化損傷有關。通過注入海人藻酸損毀nbM獲得出現幾乎所有的AD樣行為學及病理學變化，典型的老年斑（SP）廣泛見于皮層區域，tao蛋白樣神經元在扣帶回，海馬CA2區及下托和頂葉遠高于正常組。但似乎并未見有神經細胞內神經纖維絲纏結的證據。而MurayamaH等3認為聚集的AL和PDH tau蛋白磷酸化表面抗原決定簇結合并屏蔽，且能直接和PHF tao 蛋白結合，即在AD腦的神經纖維退行性變性中，出現AL與PFH tau 蛋白直接和磷酸化依賴地交互作用。利用小鼠腦室內注射AlCl3、長期腹腔內

7、連續注射或口服鋁溶液獲得出現AD病人NFT病理改變的動物模型，成為研究鋁與AD關系有效工具之一。而在鋁礦區內長期高鋁暴露是老年人群認知能力下降不利因素4，利用慢性鋁中毒制作AD模型，可用于研究環境高鋁暴露與AD關系。    2.與A沉積相關動物模型 淀粉樣蛋白（AP）是AD病人老年斑的核心部分，利用AP選擇性損毀與AD的病變密切相關的膽堿能神經元集中部位如海馬、前腦Meynert基底核等，制作的AD模型一度成為研究AD 的主要工具。 Giovannelli等5報道于腦內注射AP制作AD模型，給大鼠腦基底核注射A140和A2535淀粉樣多肽，可觀察到注射部

8、位有剛果紅染色物質聚集，CHAT活性降低及基底核膽堿能神經元減少，海馬膠質細胞反應性增生，皮質和海馬神經元數量較對照組明顯減少，神經元退化，剛果紅染色血管呈陽性，銀染提示有神經纖維絲狀物。采用同樣方法在海馬內注射A2535，發現海馬NOS陽性神經元減少，并出現NOS陽性星形膠質細胞，大鼠出現學習記憶能力下降6。隔核內注射AP未見有類似病理變化，且大鼠的分辨學習能力沒有明顯改變，Urani等7采用腦室內連續14 d單純注射A140，避免腦組織的急性損傷，未能獲得NFT等AD特征性的病理改變。盡管這些研究結果不一致，可能與使用的劑量和注射的部位有關，但腦內注入A損毀膽堿能神經元集中的部位，誘導建立

9、AD動物模型，仍不失為一類較為接近AD病人病理實際變化動物模型。    單因素損傷模型只能模擬較少部分AD病理變化的局限性，使得其在AD應用中逐漸被日益成熟的多因素損傷模型和蓬勃發展的轉基因動物模型替代。多因素損傷復合動物模型    1.雙因素聯用誘導的AD模型  A與D半乳糖（Dgal）聯合誘導的AD模型。在腹腔注射Dgal的基礎上,海馬內注射A可導致大鼠的學習記憶減退, 出現A沉積、神經元死亡、膠質細胞浸潤等8，同時可導致神經元丟失以及海馬CAl區線粒體結構損傷。該模型集衰老、A沉積和記憶功能損害等AD主要病理學改變，國

10、內應用較為廣泛。氯化鋁與Dgal聯合誘導的AD模型。采用腹腔注射 D半乳糖和AlCl3灌胃合并制備AD模型,模型組小鼠出現了膽堿能神經元及其他神經元不同程度的丟失,學習記憶能力減退,腦組織出現A沉積并有類SP和NFT形成,較成功地模擬了AD的發病及病理特征。造模后發現模型小鼠腦內海馬部位APP基因表達水平顯著提高，剛果紅染色結果顯示,海馬SP的數量明顯增加9。該模型集鋁中毒、衰老、A沉積、NFT形成和記憶功能損害于一身，造模方法簡單,造價低廉,適合大規模藥物篩選。Wortmannin和GF109203X聯用損害模型。王建枝10同時在大鼠側腦室或雙側海馬注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶

11、抑制劑)和GF109203X(蛋白激酶C抑制劑),大鼠出現明顯行為學障礙,海馬GSK3酶活性增加到原來的3.7倍， Tau蛋白一些特殊位點磷酸化明顯增強,并出現NFT樣病理變化，而骨架蛋白Tau的特殊位點的磷酸化程度與動物的學習、記憶障礙正相關,即Tau蛋白過度磷酸化程度越高,大鼠學習記憶能力越差。該類模型可用于篩選針對蛋白激酶過度激活引發的Tau蛋白AD樣異常過度磷酸化、NFT樣病理變化及學習、記憶障礙的AD治療藥物,還可用于研究蛋白激酶和AD發病機制之間的內在關系。其他雙因素聯用損傷AD模型。主要采用Dgal致衰老結合膽堿能神經系統損傷或A誘導等其他因素制作AD模型，如喹啉酸(QA)與Dg

12、al聯合誘導的AD模型，利用興奮性氨基酸受體激動劑QA海馬內注射破壞海馬膽堿能神經元，也有用具有神經毒作用的鵝膏蕈(ibotenic acid,IBO) 腦內注射結合大鼠腹腔注射Dgal方式或將A40和小劑量的IBO共同注入大鼠海馬制作AD模型，這些模型均能較好的模擬出類似AD的部分病理變化，是國內研究AD常用模型。雙因素聯用損傷AD模型在臨床上不僅有記憶功能的損害，同時兼見衰老表現，較好的模擬了AD的主要病理學改變，而動物自愈傾向和自愈時限的研究未見報告, 建立穩定性、重復性更好的模型有待進一步深入研究。    2.三因素聯用損傷致AD模型  東莨菪堿

13、(SCOP)、AlCl3與Dgal聯合誘導的AD模型。研究者在每日Dgal腹腔注射和胃飼AlCl3水溶液連續4周的基礎上于實驗觀察前腹腔注射SCOP誘導AD模型，擬建立集衰老、鋁中毒以及膽堿能系統損害為一體的三因素AD動物模型。該模型學習記憶能力顯著下降,且其記憶損害程度依次為:SCOP+AlCl3+Dgal組Dgal+胃飼AlCl3組Dgal+注射SCOP組。IBO、Dgal聯合與A140誘導的AD模型。大鼠皮下注射Dgal 56 d的基礎上于Meynert基底核一次性注射IBO和左側腦室連續7 d注射A140誘導AD模型，模型鼠出現記憶障礙,海馬皮層錐體細胞數量明顯減少,但未見NFT和SP

14、等病理改變,推測可能與腦室作用時間及劑量有關。也有學者在大鼠腹腔內連續注射Dgal 6周后再于雙側海馬內分別注射A和IBO誘導AD模型, 三種藥物聯用采用不同注射方式，均較成功模擬了集衰老、A沉積以及膽堿能系統損害為一體的類似AD病理變化，較雙因素損傷模型更能體現疾病的復雜性和病變的廣泛性，但也存在注射部位不規范、注射劑量不一致等不統一之處，有待大樣本模型驗證研究。A140、AlCl3與重組人類轉化生長因子1(TGF1)聯合誘導的AD模型  在較早期Frautschy等11設計A140 加TGF1雙因素兩位點注射的大鼠模型,在一個位點,即腦室內注射溶解的A(140),遠離前一位點的另

15、一位點注射可促進沉積的不同藥物, 避免注射位點附近大量A聚集和復雜的注射損傷的影響。研究證實TGF1和A140注射后可出現大量彌散性A沉積。國內學者于大鼠側腦室內連續14 d注入A140。連續5 d注入1%氯化鋁溶液，首次注射時在丘腦前背側核注入IOngTGF1，模型鼠不但出現大量淀粉樣蛋白沉積、ChAT活性降低，且在3個月后出現AD特征性的SP和NFT，此模型的這些特點都彌補了單因素鋁中毒模型的不足。三因素損傷模型近年開展日漸增多，筆者認為過多的損傷因素不僅加重動物的病理負擔，而且加大制作模型的難度，模型動物存活率低，模型的穩定性和可重復性必定受到不同程度影響，因此結合實驗研究目的適當選擇雙

16、因素損傷模型更為合理，如研究環境鋁暴露與AD關系可選用大鼠長期口服鋁液結合A海馬注射制作AD模型，不僅縮短造模時間，避免單一鋁中毒造模時間過長，又能更為接近環境高鋁暴露下實際狀況。結合鋁與tau蛋白磷酸化密切關系及A毒性制作的雙因素損傷AD模型更具有現實意義。在國內大多數實驗室不具備開展轉基因動物模型條件下，多因素損傷模型將是研究AD的主要選擇。轉基因動物模型    1.轉APP基因鼠  最早于1991年首次報道成功將淀粉樣蛋白前體(beta amyloid precursor proteins, APP)基因轉入小鼠后，AD轉基因動物模型成為AD研究熱

17、點。PDAPP小鼠。Games等第1次報道轉人類APP695swe和APP717VF突變的PDAPP鼠，它是由C57BL/6鼠與DBA/2F1鼠交配產生。研究發現轉入人類突變的APP基因小鼠有APP高水平的表達，并于69月時在海馬、胼胝體及大腦皮層出現細胞外大量的AP沉積、神經炎斑塊、突觸喪失和小膠質細胞增生等類似AD的病理特征，但未見形成NFT。轉入人突變型APP基因并表現A沉積的小鼠轉基因模型,標志著AD轉基因動物模型研究進入了新階段。而Dave M12用AP疫苗免疫轉基因鼠能夠顯著的減少淀粉樣沉淀及減輕記憶力下降，支持AP作為AD中心角色的假說，轉PDAPP基因鼠為研究AD帶來新的突破，

18、使得AD研究得到前所未有的高度。Tg2576小鼠。Hsiao等13申請了專利的轉基因鼠。Tg2576小鼠是轉人類APP695基因小鼠,存在2個位點突變:670位賴氨酸突變成天門冬酰胺和671位蛋氨酸突變成亮氨酸。該小鼠在912個月時出現SP，隨著A量的增多,A沉積逐漸出現在額葉、顳葉、內嗅皮質、海馬、海馬回鉤前部、海馬回和小腦，其行為學改變有學習和記憶損傷等。Tg2576小鼠成功研制使其成為研究AD的提速工具，得到廣泛應用。APP23小鼠。將人類APP695基因通過倉鼠由轉人類APP695鼠和APP V717I鼠交配得來的APP23小鼠，比正常小鼠腦內多7倍的APP。在6個月時已有A沉積，到24個月時大量出現在皮質和海馬,同時出現炎性反應:神經炎、突觸損傷及tau過度磷酸化，A沉積隨著年齡增長出現數量和體積增多。大腦淀粉樣血管病更加區域化，在腦脊液中出現更多可溶性A,SP比AD腦中的斑點可溶性更高。空間記憶障礙開始出現在