1、    遺傳性非息肉病性大腸癌基因研究進展劉碩陸萍宮恩聰 大腸癌(colorectal cancer， CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈上 升趨勢。環境因素及遺傳因素在其發病過程中起重要作用。遺傳因素導致的大腸癌主 要有兩種，其一是家族性大腸腺瘤息肉病(FAP)導致的大腸癌，約占CRC總數的1%； 其二是遺傳性非息肉病性大腸癌綜合征(herediary nonpolyposis colorectal cancer， HNPCC)， 約占CRC總數的15%18%，亦有報道占5%左右1，2。HNPCC是一種常染色體顯性遺傳 性疾病3，其發病特

2、點是：(1)早期發生大腸癌；(2)大腸以外多器官受累4。HNPC C缺乏明顯的臨床及病理學特點，給早期發現及診斷帶來一定困難。Toshlaki Watanbe等 近來報道在HNPCC患者發現的73例息肉中，有37例平坦型腺瘤息肉，因而認為平坦型 腺瘤可能是部分HNPCC的癌前期病變5。 HNPCC的國際通用診斷標準(amsterdam criteria)是在一個家系連續2代的親屬中有 3名以上大腸癌患者，且至少有1名患者在發病時年齡小于50歲。在部分HNPCC家族 中，大腸以外的器官如子宮、卵巢、胃、腎等消化及泌尿生殖道也易發生惡性腫瘤6。 我們就HNPCC的研究狀況、基因定位、基因結構、功能

3、、常見的基因突變方式、檢測 基因突變常用方法及探索性治療作一綜述。 1 HNPCC的簡單回顧 自從1895年Aldred Warthin's報道第1例家族性大腸癌至今有整整100多年的歷史了6，8，9， 但Aldred Warthin's的報道在當時并未引起重視。直到1966年，又有人報道兩個類似 家族，才又一次引起了人們的關注，并將其命名為癌家族綜合征，不久又改稱HNPCC6，10。 近年來，遺傳易感性基因一直是遺傳學家研究的熱點。早在六、七年前，芬蘭赫 爾辛基大學的著名遺傳學家Albert de la chapelle教授及其合作者便開始了這項工作。他 們在發現FAP與遺傳

4、易感性相關的同時，也發現一些沒有息肉等明顯特點的結腸癌患 者，同樣具有遺傳易感性，且占大腸癌發病總數的5%15%2，5，而FAP僅占1%。由 于同一家族的成員受飲食、環境因素的影響相似，這些非FAP患者的遺傳易感性還顯 得缺乏說服力。1989年，Vogel-stein和de la Chapelle決定合作研究這些家族是否存在遺 傳易感性7。 2 HNPCC基因定位及功能探討 協作組最初將工作重點放在確定來自癌家族的結腸或其它器官的癌瘤是否與p53、 DCC、APC等與結腸癌發生相關的基因有關。連鎖分析表明這些基因與HNPCC的遺傳易 感性無關。接著他們把焦點放在一個大家族上，結果又一無所獲。恰

5、在這時，一個27歲 的癌家族成員患了結腸癌。患者年齡之輕，使他們又一次充滿了信心。此時法國的 Jean Weissenbech研究組和James Weber等11研究出一組新的DNA標記，即微衛星DNA (microsatellite DNA)，它是大量隨機分布于整個基因組中的串聯重復序列，可作為常見 遺傳病易感性基因定位的理想標記。Bert Volgelstein和Albert dela Chapelle等人研究了345 個微衛星標記后，發現在兩個家族中HNPCC基因與D2S123均未見重組，提示其緊密連 鎖。D2S123尚未確切定位，但研究發現其位于D2S5遠端5cM，且D2S5已經原位雜

6、交、 連鎖分析和體細胞雜交定位于2p15-16，因而將HNPCC基因之一定位于2p15-16,暫時命 名為FCC，后又改名為hMSH211，12。 此后,Nickolas Papadopoulos等在研究兩個HNPCC家族時，發現這兩家族與2p上的標 志無關，提示存在其它的HNPCC基因。于是他們用"已表達序列標志"(expressed sequence tag，EST)又鑒定3個與酵母mut L極其相似的基因。其中與mut L最相似的被 命名為hMLH1，另兩個被分別命名為hPMS1和hPMS2。體細胞雜交將它們分別定位于3、 2、7號染色體上。由于位于3p21的標志先前

7、已發現與HNPCC相關，所以hMLH1引起人們 的極大興趣，進而用基因組DNA與人類染色體進行熒光原位雜交，結合復染，將hMLH1 定位于3p21.3區段上13，14。 研究者們起初認為HNPCC基因與其它幾個結腸癌相關基因如APC、p53一樣，是經 典的腫瘤抑制基因。后者在腫瘤發生過程中至少要丟失兩個拷貝的其中一個，但de la Chapella、Vogelstein研究組用2號染色體標志在家族成員的癌標本中并未鑒定出 缺失，而代之以2號染色體標志點的微衛星DNA長度的改變，進而他們在幾乎所有分析 過的家族性腫瘤中均看到了類似的改變。以上工作表明，由于2號染色體上的基因改 變，導致結腸癌細胞

8、中的DNA在整體上沒有被精確地復制。這一結果使他們想到了原 核生物的mutS及mutL基因。后二者是錯配修復基因，其產物參與識別、校正錯配堿基 對mutS和mut L的失活，導致了遍布整個基因組的微衛星序列的改變。經PCR擴增與克 隆分析，發現了人類具有與原核生物mutS、mutL的極其相似的同源序列，即hMSH2和 hMLH1，此二基因是人類的錯配修復基因，負責人DNA復制的精確性。 3 hMSH2、hMLH1基因結構 為了確定定位于2p15上的hMSH2的基因序列，Fredrick S. Leach等用PNP-23的插 入片段篩選了用人類結腸癌細胞或胎兒腦組織構建的cDNA文庫。用探針雜交

9、法及cDNA 步移法(cDNA Walk)共鑒定出147個cDNA克隆，經過對這些克隆的綜合分析，得出了hMSH2 的cDNA序列，其開放的讀碼框架起始于cDNA5"末端下游的69nt處， 共有2 802bp。 起始這一開放的讀碼框架的蛋氨酸處于能進行有效翻譯的適當位置，讀框內具有一個 終止信號11。Stefan J用PCR法篩選了人P1基因庫，分離出hMSH2的起動子區，并對 P1重組DNA直接測定，分析了hMSH2起動子1 100bp特點。起動子序列包含了許多蛋白結 合位點，但未發現常見的TATA和CAAT box，這種結構是多數管家基因起動子的典型結構。 如Bert Vogel

10、stein所說，hMSH2和hMLH1是所有管家基因的母基因15。hMLH1的cDNA 序列亦經類似的方法獲得，其開放的讀碼框架開始于cDNA5"末端下游的第42位核苷酸， 共2 268個bp。讀框內有適于有效翻譯的起始蛋氨酸和終止信號，且hMLH1與mut L的讀 碼框架在全長范圍內明顯相似13。 4 hMSH2、hMLH1的常見突變方式 為證實hMSH2與HNPCC的關系，Leach等和Parsons等分別研究了2個和29個HNPCC家族， 并用正常個體作對照。結果發現了hMSH2的突變分散于5、7、8、12、13、15等外顯子， 缺乏突變熱點，但除了第12外顯子在622密碼子處

11、發生單個堿基突變外，其余多數突變均 是大片段的缺失16，17。Nickolas Papadopoulos等對10個與3P標記相關的HNPCC家族 的hMLH1基因進行研究，確定了hMLH1的常見突變方式與hMSH2相似，除在252密碼子處發 生單個堿基突變外，其余突變多數也是大片段的缺失13。 5 hMSH2、hMLH1突變檢測的常用方法 由于hMSH2、hMLH1突變分散于較多的外顯子中，因而給檢測帶來一定困難。但它 們的突變方式主要是大片段的缺失，這對cDNA擴增后電泳分離檢測又是一個有很有利 的條件。目前常用的檢測方法主要有以下幾種：(1)擴增、檢測其基因組DNA。提取組 織或淋巴細胞中

12、的基因組DNA，利用內含子、外顯子交界處設計引物，分別擴增多個外 顯子，然后進行瓊脂糖電泳或SSCP。該方法的優點是用DNA作模板，避免了RNA操作的 繁瑣與RNA酶降解的危險性，且檢測完整無遺漏。缺點是需要多對引物及多次PCR，耗 資費時。Ling Xia等最近發現先前作為胚系突變的13外顯子缺失，在90%以上受檢者 淋巴細胞RNA中均能檢查到，因此認為13外顯子缺失是人群中的一種正常變異18。 這一發現對正確估計HNPCC家族成員風險率具有深遠意義；(2)分段擴增患者及正常對 照hMSH2、hMLH1之cDNA，然后電泳及SSCP檢測；(3)IVSP(in vitro synthesize

13、d protein) 法：即提取mRNA，反轉錄出cDNA，再經PCR擴增，產物進行體外轉錄、翻譯，電泳比 較蛋白產物，根據缺陷性蛋白，再檢測其基因變化；(4)檢測突變相對集中的hMSH2的 exon5。由于exon5突變率約占HNPCC突變總數10%，可以將exon5的PCR產物經MSeI消 化，正常的產生69nt和17nt兩個片段；而突變者產生39、30、17 3個片段。此法檢查 相對熱點exon5較為快捷，但漏診率高19。 6 治療HNPCC方法初探 目前試探性治療方法主要有以下幾種：(1)對整個大腸進行預防性篩查，手術切除 檢出的同步性多發腫瘤2；(2)行全結腸切除及回直腸吻合術，防止

14、異步性多發腫瘤 的發生。由于HNPCC基因突變攜帶者患子宮內膜癌的危險率較高1，20，對無生育要 求的女性HNPCC患者或攜帶者還應行子宮及雙側附件切除術；(3)單純切除癌灶者，應 定期進行內窺鏡及宮腔鏡檢查，做好隨訪防治工作。最近John I. Risinger等報道，乳腺 癌亦是HNPCC綜合征的一部分5，應予注意。 綜上所述，HNPCC基因突變攜帶者數量較多，又缺乏明顯的臨床指征和有效的監 測手段，因此利用HNPCC基因研究的新成果，建立起檢測HNPCC基因突變的簡單、快速、 特異、敏感的基因診斷技術，采取適當的治療方法，對提高大腸癌的早期診斷率和 治愈率、提高人口素質等方面，具有重要意

15、義。 作者單位：100083 北京醫科大學病理系(劉碩、宮恩聰)；山東省棗莊市立醫 院病理科(陸萍) 參 考 文 獻 1 Markku A, Jukka-Pekka M, Lauri A， et al. Life-Time risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome. Int J Cancer (Pred. Oncol.), 1995, 64430. 2 Rossella F, Luca R, Carmela D, et al. Frequency and cl

16、inical features of multipe tumors of the large bowel in the general population and in patients with herediatry colorectal carcinoma. Cancer, 1996, 772013. 3 Lauri A, Altonen PP, Jukka-Pekka, et al. Replication errors in benign and malignant tumors from hereditary nonpolyposis, Colorectal cancer pati

17、ents. Cancer Res, 1994, 541645. 4 Green RC, Narod SA, Morasse J, et al. Hereditary nonoplyposis colorectal cancer: Analysis of linkage to D2S123 and reveals genetic heterogeneity in seven canadian families. Am J Hum Genet, 1994, 541067.5 Toshlaki W, Tetsuichiro M, Toshio, et al. Flat adenoma as a pr

18、ecursor of colorectal carcinoma in hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. Cancer, 1996, 77627. 6 Lauri AA, Pairi P, Frdrick SL, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 1993, 260812. 7 Jean M. New colon cancer gene discovered. Science, 1993, 260751. 8 Henry T,L

19、ynchT, Thomas CS, et al. Genetics, natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cancer: An updated review. Gastroenterology, 1993, 1041535. 9 Henry TL, Thomas CS, Jennifer C, et al. Identification of an HNPCC family. AJG, 1994, 89605. 10 Paivi P, Lauri AA. Genetic mapping of a locus predisposing to human colorectal cancer. Science, 1993, 260810. 11 Fredrick SL, Nicholas C, Nicolaides NP, et al. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis