1、.PCR污染的產生及防治污染的產生及防治分子生物學技術平臺討論會PCR系列之一2008-2-28.PCR污染的監測污染的監測 PCR強大擴增能力強大擴增能力+檢測的敏感性檢測的敏感性經經30個周期后，特定個周期后，特定DNA片段的數量在理論上可增加片段的數量在理論上可增加109倍倍極微量的污染便可導致假陽性，尤其對定量造成很大的問題極微量的污染便可導致假陽性，尤其對定量造成很大的問題NTCNTC (No Template Control): (No Template Control): 必須必須設置一個不含模板設置一個不含模板DNA但含有但含有PCR系統中所有其他成分的對系統中所有其他成分的對

2、照反應，這一對照管須在準備好所有其他照反應，這一對照管須在準備好所有其他PCR以后才進行吸加。以后才進行吸加。 .常見的常見的PCR contamination 常規常規PCR 熒光定量熒光定量PCRNTC432176598NTC.引起引起PCR污染的原因污染的原因 模板間交叉污染模板間交叉污染容器被污染模板放置時, 由于密封不嚴溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉污染模板吸取過程中, 因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導致交叉污染.引起引起PCR污染的原因污染的原因 PCR試劑污染試劑污染PCR 試劑配制過程中, 移液器、容器、水等原因造成試劑被PCR 核酸模板污染

3、。.引起引起PCR污染的原因污染的原因 PCR產物污染產物污染-最主要最常見最主要最常見PCR 產物拷貝量大，極微量的PCR產物污染, 就可形成假陽性。移液器吸取PCR產物進行電泳檢測，同一支移液器去準備PCR mixPCR產物的氣溶膠污染： 一個氣溶膠顆粒可能含幾萬個拷貝氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質中粒徑一般為 0.001m1000m的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態散體系。空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠, 在操作時比較劇烈地搖動反應管, 開蓋時、吸樣時及移液器的反復吸樣都可形成氣溶膠.引起引起PCR污染的原因污染的原因 實驗室中克隆質粒的污染實驗室中克隆質粒的污染克隆質粒濃度

4、高, 另外在純化過程中需用較多的用具及試劑, 其污染可能性也很大.防止防止PCR污染污染首要原則首要原則 永遠要設置永遠要設置NTC對照對照 如果不能在污染出現的第一時間發現，會導致嚴重的如果不能在污染出現的第一時間發現，會導致嚴重的后果：一大段時間的數據不可信后果：一大段時間的數據不可信 準備準備PCR的移液器要專用的移液器要專用 千萬不能千萬不能用吸取用吸取PCR產物產物/克隆質粒的移液器去準備克隆質粒的移液器去準備PCR 體系體系.防止防止PCR污染污染空間：空間： 合理分隔實驗區域:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區進行，特別注意樣本處理及PCR

5、產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。 理想狀態：理想狀態： 各個區域實驗用品及移液器專用，實驗前應將該區域用紫外線消毒，破壞殘留的DNA或RNA。.防止防止PCR污染污染操作操作一旦進入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應戴上一副新手套，并應勤于更換。準備專供自己使用的PCR試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起。選擇質量好的Eppendorf管-密封性好且開管不需要太大力氣打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。實驗結束后及時清理臺面.防止防止PCR污染污染移液器操作移液器操作由于操作時不慎將模板吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣時要

6、十分小心。1）準備PCR的移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應成分后才吸加模板。4）推薦在準備PCR過程中使用濾芯槍頭. 選用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶 Uracil-N-Glycosylase)的試劑，有助于防止PCR產物引起的污染。UNG：50攝氏度，2分鐘，作用于含有dU的DNA雙鏈或單鏈然后開始PCR反應的預變性步驟，同時UNG失活防止防止PCR污染污染對于不含dU的PCR產物無效.出現污染后解決辦法出現污染后解決辦法更換試劑更換試劑 更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用更換新的試劑

7、和水，用確保無污染的移液器分裝備用清潔所有可能的污染源：實驗臺面、小離心機、冰箱門把手等等清潔所有可能的污染源：實驗臺面、小離心機、冰箱門把手等等 1）實驗臺面、超凈工作臺用現配的）實驗臺面、超凈工作臺用現配的3%雙氧水或雙氧水或10%次氯酸鈉次氯酸鈉溶液擦拭清潔。溶液擦拭清潔。 2）或者用）或者用10%漂白粉溶液擦拭漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距離應不超過紫外光照射，照射距離應不超過90 cm，照射時間最好過夜。，照射時間最好過夜。實驗過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法實驗過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法.參考文獻參考文獻 Kwok S ,Higuchi R. Avoiding false positives with PCRJ . Nature ,1989 ,339 (6221) :237 - 238. Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi:10.1101/pdb.top1