1、摘 要目的 藥物敏感性試驗簡稱藥敏試驗，旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感程度，指導臨床合理選用抗生素的種類和用量，以做到利用藥物對疾病進行更加準確的治療。由于在實踐操作中所進行的各種標準藥敏試驗的周期較長，一般需要耗用幾十個小時，且操作過程較復雜，需要有經驗的專業實驗人員進行反復驗證。因此，建立靈敏、快速和操作簡單的藥物敏感性試驗方法在科研應用方面具有非常重要的意義。本研究以普魯士藍(PB)為光學探針，大腸埃希氏菌(E. coli)為模型微生物所構建一種新型的光學體外藥敏試驗方法，用于快速的檢測出藥物有效性及篩選出抗菌新化合物，彌補現有的方法缺陷。方法實驗以K3Fe(CN)6為電子受體，定

2、量轉移微生物呼吸作用所產生的電子，自身被還原為K4Fe(CN)6，與后續加入的FeCl3反應生成普魯士藍(PB)。當微生物的活性受到抑制時，其呼吸作用會減弱，相應生成的PB的量也會減少。因此，可通過700nm處測定PB的吸光度確定受試微生物活性變化。通過考察Fe(CN)64-的生成量，確定體系的稀釋倍數和FeCl3的加入量；通過考察吸光度值與E. coli固定時間的關系，確定氧化石墨烯(GO)固定E. coli的最佳時間；通過比較固定化E. coli在Luria-Bertani(LB)培養基和磷酸緩沖溶液中活性隨存儲時間的變化趨勢，確定最佳存儲條件；根據吸光度值的變化，將最優條件下制備的GO固

3、定E. coli顆粒用于檢測阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素、頭孢噻肟鈉5種抗生素的有效性。結果4h培養時間內，45 mmol/LK3Fe(CN)6足夠用于轉移微生物呼吸作用產生的電子，但生成的K4Fe(CN)6量過多，導致生成的PB沉淀，因此應在加入FeCl3之前，將培養液稀釋至5 mmol/L。當固定時間為16 h時，以具有表面GO結構的石墨顆粒為載體的E. coli固定效果最好。培養相同的時間，在PBS中保存的GO固定E. coli的吸光度值比其在培養基中保存時的吸光度值小。以GO固定E. coli為受體的光學方法進行藥物的有效性檢測中，抗生素對菌體活性的影響與接觸時間和抗生素種

4、類相關。阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星和頭孢噻肟鈉均可對E. coli產生明顯抑制作用；相比之下，萬古霉素的作用較弱。結論 與一般的藥物有效性檢測方法不同，在優化條件下的基于GO固定E. coli的PB光學檢測方法更加簡便、快捷、低耗、價廉，同時具有較好的靈敏度。所以，該方法在抗菌類藥物的檢測和臨床診斷方面具有一定的應用潛力。關鍵詞：藥敏實驗；普魯士藍；光學方法；抗生素；藥物有效性 ABSTRACTObjective The drug susceptibility test referred to as the drug sensitivity test, which is designed

5、to understand the sensitivity of pathogenic microorganism to various antibiotics in order to guide clinical rational selection of the types and dosage of antibiotics. So the drug susceptibility test ensures a more accurate use of drug to treat the objective disease. However, the testing cycle of var

6、ious standard drug susceptibility tests are so long, even spending dozens of hours. Otherwise, the standard drug susceptibility test is often needing complex operations and professionals to repeatedly verify the accuracy of the test results. Therefore, establishment of a rapid, sensitive and simple

7、drug susceptibility test is of great significant in scientific research and application. .This study applies a common dye - Prussian blue (PB) as a optical probe and Escherichia coli (E. coli) as a model microorganism to build a novel optical drug susceptibility test in vitro for rapid detection of

8、drug effectiveness and screening of new antibacterial compounds. We expect that this novel method is making up the defects of existing drug susceptibility test. Methods In our test, K3Fe(CN)6 that was as a electron carrier was used to transfer the electrons from bacterial respiration. Then reduction

9、 product of K4Fe(CN)6 was mixed with an addition of FeCl3 to generate prussian blue (PB). The bacterial respiration should be weakened when the bacterial activities were inhibited. So the production of PB was reduced. Therefore, the bacterial activities could be measured at PB absorbance of 700 nm.

10、Production of Fe(CN)64- was studied to ensure a suitable dilution ration of our system and additional concentration of FeCl3. The relationship between absorbance value and immobilized time was studied to screen an optimum immobilized time of E. coli on GO. Two different stored methods, such as Luria

11、-Bertani (LB) culture and phosphoric acid buffer solution, were respectively studied to screen an optimum stored condition. Finally, our optimum conditions were used to prepare GO immobilized E. coli for detecting the effectivenesses of antibiotics, such as amikacin, gentamicin, levofloxacin, vancom

12、ycin and cefotaxime sodium. Results K3Fe(CN)6 of 45 mmol/L was enough to transfer all electrons from bacterial respiration within 4 h incubation time. But the production of K4Fe(CN)6 was too many to produce stable PB solution. So the incubation culture should be diluted and ensured the content of K4

13、Fe(CN)6 of 5 mmol/L before addition of FeCl3 solution. The optimum immobilized time of E. coli was 16 h when the graphite particles was modified with GO structure on its surface. At the same incubation time, the PB absorbance produced by respiration of E. coli that was stored in the PBS was lower th

14、an E. coli that was stored in the LB culture. The GO immobilized E. coli was as testing model to apply into test of drug effectiveness with optical method. All results showed that the effectivenesses of antibiotics on the bacterial activities were related to the contact time and the kinds of used an

15、tibiotics. The antibiotics of amikacin, gentamicin, levofloxacin and cefotaxime sodium all showed obviously inhibitions on the respiration of E. coli. Comparing with other four kinds of antibiotics mentioned above, the effectiveness of vancomycin was weaker. Conclusion It was different from general

16、drug effectiveness detection method, the PB optical detection method with GO immobilized E. coli was simpler, lower consumption, rapider and cheaper, well with good sensitivity. So our study has a cetrain potential in the detection and clinical diagnosis of antibacterial drugs. Keywords: Drug suscep

17、tibility test; Prussian blue; Optical methods; Antibiotics; Drug effectiveness前 言隨著抗菌藥物在我們日常生活中的廣泛使用，導致越來越多的細菌開始對藥物產生耐藥性，給由細菌導致的疾病的治療帶來了非常大的困難。目前致病性耐藥菌已成為大家廣泛關注的一個問題，要解決這一嚴峻的問題不僅需要我們有不亂使用抗生素的意識，同時也需要研發出新的更有效的抗生素開對抗細菌以及耐藥菌。但是現在生產抗生素的技術發展非常的緩慢，相關的研究也不是很規范，達不到現在醫藥生產企業對藥品生產效率的要求，影響了企業對新藥的研發進程。研發新藥時需要建立藥

18、物量-效曲線關系模型以及確定所治療疾病。研發抗菌藥物，確定目標疾病與篩選微生物和劑量確定是分不開的。測藥物對微生物抑制作用的大小所用的方法為藥物的敏感性實驗，他是估計藥物對細菌抑制作用的比較方便的方法，且由于其具有較好的準確度和重復性，所以被用于初期篩選新藥以及監測抗菌藥物療效和檢測細菌耐藥性。在對藥物進行敏感實驗時宜用陰性對照的方法，但是近年來在藥物的提取，合成以及后來的藥物敏感性檢測中有較大量的使用，所以一般的陰性對照試驗對藥敏實驗的安全和準確已不能保障。新藥的研發除了需要時間，大量的人力物力，還要克服成功率低，具有相對較高的風險，周期和投入等實際問題。現在紙片擴散法仍然是作為抗菌藥物進行

19、有效性檢測的體外測試方法，但紙片擴散法的實驗周期相對較長，需要消耗大量的試劑且需要專業的工作人員操作，給藥物的研發增加了很多的任務。因此我們需要尋找能克服上述缺點的一種方法來完成對臨床進行藥效監測和研發新的抗菌藥。例如，PCR技術。這些新的藥敏實驗方法能夠更快速，更靈敏的獲取耐藥性微生物的信息。雖然新型的藥物檢測方法相對于傳統方法在靈敏度、準確度方面有優勢，但是新型的藥敏實驗方法需要更高的實驗費用。本實驗采用光學方法，以鐵氰化鉀做為反應體系，通過微生物的呼吸作用使之發生電子轉移生成亞鐵氰化鉀，然后根據其與三氯化鐵生成普魯士藍進行光學檢測。通過探究微生物使用的濃度，培養的時間以及所給的營養物質對

20、靈敏度的影響確定適宜的檢測條件。并應用哌拉西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星和左氧氟沙星5種常見抗生素對20株E. coli臨床分離物的實際檢測。然后與傳統的藥物敏感性實驗結果進行比較。實驗部分1 儀器和試藥1.1 材料和試劑磷酸氫二鈉 天津市瑞金特化學品有限公司，磷酸二氫鉀 天津市博迪化工有限公司，硼酸 沈陽市聯邦試劑廠，無水碳酸鈣天津永晟精細化工有限公司，葡萄糖 北京化工廠，鐵氰化鉀 天津博迪化工股份有限公司，谷氨酸，鹽酸左氧氟殺星氯化鈉注射液 黑龍江科倫制藥有限公司 批準文號：國藥準字 H20055367，硫酸慶大霉素注射液 河南潤弘制藥股份有限公司 批準文號 H41020318，硫酸阿

21、米卡星注射液 江蘇吳中醫藥集團有限公司蘇州制藥廠 批準文號H32021408 ，注射用鹽酸萬古霉素 浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠 批準文號H20033366，頭孢噻肟鈉 哈藥集團制藥總廠 批準文號H23021721，3,5-二氯苯酚(DCP) 沈陽市聯邦試劑廠。實驗用的E. coli來自于錦州醫科大學附屬一院，經活化后用15%甘油置冰箱中冷凍保存。1.2 溶液配制Luria-Bertani(LB)培養基：胰蛋白胨10.0g L-1，酵母粉5.0g L-1，NaCl 10.0g L-1，用0.1mol L-1 NaOH調節pH至7.4±0.2，120°C滅菌20 min，待

22、用。PBS：0.12mol L-1 Na2HPO4，0.08mol L-1 KH2PO4。 GGA：葡萄糖150mg L-1，谷氨酸150mg L-1。K3Fe(CN)6儲備液：采用去離子水配制330mmol L-1 K3Fe(CN)6，實驗當天使用。1.3 實驗儀器電化學工作站820C 才華儀器有限公司，CJJ79-1磁力加熱攪拌器， 電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；721紫外分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；潔凈工作臺SW-CJ-1E(潔凈等級100級) 上海博迅實業有限公司。2 方法和結果2.1 石墨烯顆粒的制備GO不僅具有很好的電子傳導速度(1000

23、m/s)，其結構和組成的特殊性也使得該材料的光學性能、生物相容性和機械強度等性質較為優越，所以在生物傳感領域應用廣泛。本文通過制備具有表面GO結構的載體，固定E. coli，用于開發抗生素類藥物有效性檢測的光學微生物傳感技術。準確稱取150g石墨棒將其切成15cm左右長度放置于500mL中，用量筒準確量取200mL濃硫酸，將其緩慢倒入燒杯中浸沒石墨棒，充分反應20min。準確稱取NaNO2和KMnO4各5g備用。先將NaNO2投入石墨棒-濃硫酸反應體系中，并迅速轉移至冰水浴中保存；投入已準備好的KMnO4，用玻璃棒持續攪拌。待石墨棒表面出現大量的孔隙且攪拌費力時，立即將燒杯放入溫水浴中1min

24、，再轉移至80的水浴鍋中，直至燒杯壁上有大量的氣泡附著時,加入200mL的去離子水停止反應。加入10%鹽酸后，將表面具有大量GO結構的石墨棒趁熱過濾，并用去離子水洗滌數次至無SO42-為止。將表面具有大量GO結構的石墨棒封入透析袋，置于裝有去離子水的大燒杯中浸沒，隔兩小時換一次水，并用pH試紙測定其酸堿度。待pH近中性，取出短棒，放入恒溫搖床于37烘干后，切成3cm左右的顆粒置于燒杯中備用。2.2 GO固定大腸桿菌顆粒的制備在無菌條件下將0.2mL E. coli菌種接種到已滅菌的300mL LB培養基中后，向培養基中投入切粒整齊的具有表面GO結構的石墨顆粒，以滅菌錫紙封口，并置于恒溫搖床中培

25、養。達到預定培養時間后,以滅菌藥匙撈出GO固定E. coli顆粒，備用。2.3 電化學方法測試Fe(CN)64-的濃度新鮮配330mmol/LK3Fe(CN)6儲備液并將其存放在冰箱里保存，取4支1mL心管分別加入0.1mL的45mmol L-1 的K3Fe(CN)6溶液，0.1mL的220mg L-1的GGA溶液，然后用新鮮配置的PBS溶液將其稀釋至1mL。向4支小離心管中分別投入已經18h培養的GO固定E. coli顆粒后，置于37°C的恒溫搖床中培養，分別于1h、2h、3h和4h一管進行測試。根據前人研究表明，E. coli呼吸作用所產生的電子可通過Fe(CN)63-轉移至微生

26、物體外，同時Fe(CN)63-轉變成 Fe(CN)64-，因此可采用電化學工作站結合計時電流法檢測培養液經不同培養時間所含Fe(CN)64-的量。置外加電壓為450mV，工作電極為Pt微陣列電極，參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl)電極，對電極為鉑電極，響應時間為15s如下圖2.3a所示，隨著培養時間的增加，極限電流值也在不斷增大，說明培養液中所含的Fe(CN)64-的量在不斷增加。以5mmol/L K4Fe(CN)6的極限電流值為參考，計算不同培養時間時，培養液中所含Fe(CN)64-的濃度(圖2.1b)。當培養時間分別為1h、2h、3h和4h時，所測得的電流值分別為3.202e-8A、7

27、.969e-8A、9.832e-8A、12.62e-8A ，5mmol/L K4Fe(CN)6的電流值為2.000e-8A，由比例關系可求得相對應時間內因微生物呼吸作用產生Fe(CN)64-的濃度分別為8.004mmol/L、19.92mmol/L、24.58mmol/L、31.55mmol/L。因K4Fe(CN)6與FeCl3反應所生成普魯士藍的摩爾比為1:1，所以可根據上述計算結果得出需要加入的FeCl3量。但根據實驗結果，當加入FeCl3的濃度超過5mmol/L時，普魯士藍絮凝，因此應適當稀釋含有Fe(CN)64-的培養液后再加入FeCl3，使之生成穩定的普魯士藍溶液。Fig2a The

28、 curve of relationship between incubation time and limiting current圖2a 培養時間和計時電流的關系曲線 Fig2b The curve of relationship between incubation time and potassium ferrocyanide concentration.圖2b 培養時間和亞鐵氰化鉀濃度的關系曲線2.4 篩選GO固定E. coli的最佳反應時間在無菌條件下將0.2mLE. coli菌種接種到已滅菌的300mLLB培養基中后，向培養基中投入切粒整齊的具有表面GO結構的石墨顆粒，以滅菌錫紙

29、封口，并置于恒溫搖床中培養6h、8h、10h、12h、16h、18h、20h和24h。達到培養時間后,以滅菌藥匙撈出GO固定E. coli顆粒，備用。將已固定細菌的GO顆粒置于由0.1mL、0.15g/LGGA溶液，0.1mL、0.045mol/L K3Fe(CN)6溶液以及0.8mLPBS溶液所組成的培養液中反應1h。PBS溶液是由 0.12mol?L-1 Na2HPO4以及0.08mol?L-1 KH2PO4配制而成。根據2.3實驗結果，制備普魯士藍溶液前應對培養液適當稀釋：用槍頭精確吸取培養液0.2mL，加入1mL的去離子水稀釋，然后加入新鮮配置的0.08mol/L的FeCl3溶液2mL

30、，搖勻，生成普魯士藍。利用紫外分光光度計于700nm處測定普魯士藍的吸光度，因普魯士藍的生成量與微生物的活性成正比關系，因此可根據所測得的吸光度值篩選GO固定E. coli的最佳反應時間。實驗數據如圖2.3所示，隨著培養時間的增加，吸光度值也在增加；當培養時間為18h時，其吸光度值達到最大；當培養時間大于18h時，其吸光度值隨著培養時間的增加而下降，應是由于E. coli逐漸增加，培養物質逐漸匱乏而導致菌體活性下降所致。所以由實驗可得，采用表面氧化技術制備的GO顆粒固定E. coli的最佳生長時間為18h，后續實驗中均采用18h作為固定化時間。Fig2.4 The curve of absor

31、bance value changes depending on time spend of GO immobilized E. coli圖2.4 吸光度值隨GO固定E. coli的反應時間變化曲線2.5 不同的保存條件對E. coli活性的影響將已經18h培養，收獲的GO固定E. coli顆粒分別置于已滅菌的PBS溶液或原培養基中保存，用于保存的溶液必須完全浸沒GO固定E. coli顆粒。分別于保存的1d-10d無間斷的在兩種保存條件下各隨機選取4粒GO固定E. coli顆粒作為測試對象，采用如2.4所述光學方法檢測E. coli的菌株活性。實驗的結果如圖2.5-1和2.5-2所示，同一保存

32、條件下，吸光度值隨著在K3Fe(CN)6體系中培養時間的延長而增加，說明增加培養時間可有效提高Fe(CN)64-的生成量；雖然經相同的K3Fe(CN)6體系培養1h、2h、3h和4h，但隨著存儲時間的增加，采用不同存儲方式的GO固定E. coli顆粒產生的Fe(CN)64-的量均明顯下降，表現為所對應的吸光度值與前一天相比均有所降低；此外，經相同的保存時間，相同的培養時間和培養條件，在培養基中保存的GO固定E. coli顆粒的活性優于PBS中保存的GO固定E. coli顆粒的活性，表現為培養基中保存的GO固定E. coli顆粒所產生的吸光度值更高。相對于單純的PBS保存，培養基可持續供給固定化

33、E. coli營養物質，所以，于培養液中保存的菌株活性持續的時間較長。由實驗結果可觀察到，保存時間和保存條件均會對固定化E. coli的活性產生影響，因此在應用中應慎重選擇微生物的保存方法，并明確規定保存時間。Fig.2.5-1 The curve of absorbance value changes depending on incubation time of GO immobilized E. coli stored in PBS solution at different storage time. 圖2.5-1 經不同存儲時間，存儲于PBS溶液中的GO固定E. coli吸光度值隨培

34、養時間變化曲線Fig2.5-2 The curve of absorbance value changes depending on incubation time of GO immobilized E. coli stored in culture at different storage time.圖2.5-2經不同存儲時間，存儲于培養基中的GO固定E. coli吸光度值隨培養時間變化曲線2.6 不同種類和濃度的藥物對大腸桿菌活性的影響分別選取阿米卡星，慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素、頭孢噻肟鈉考察GO固定E. coli對各類抗生素的靈敏度。阿米卡星的有效性檢測：配制好母液800 mg/

35、L，設置6個濃度梯度，即0mg/L 、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L。分別吸取母液0mL、0.05mL、0.075mL、0.1mL、0.125mL、0.15mL于12個離心管中，每只離心管中再加入0.1mL 0.15g/LGGA、0.1mL 0.045mol/L K3Fe(CN)6溶液，用采用滅菌的PBS緩沖溶液補齊培養液至1mL，每個濃度梯度設置2個樣品。加入GO固定E. coli，置于恒溫搖床中反應1h，稀釋后補入FeCl3，制備普魯士藍溶液，用紫外分光光度計于700nm處測定其吸光度，求每個濃度梯度吸光度的平均值，進而監測E. coli的活性變化。慶大霉素

36、的有效性檢測：配制好母液400mg/L，設置6個濃度梯度，即0mg/L 、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12個離心管中，每個濃度梯度設置2個樣品，后續方法與阿米卡星的有效性測試方法相同。左氧氟沙星的有效性檢測：配置好母液400mg/L，分別設置6個濃度梯度，0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL于12個離心管中，每個濃度梯度設置2個樣品，后續操作與上述阿米卡星有效性測試方法相同。萬古

37、霉素的有效性檢測：配制好母液400mg/L，設置6個濃度梯度，即0mg/L 、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12個離心管中，每個濃度梯度設置2個樣品，后續操作與上述阿米卡星有效性測試方法相同。頭孢噻肟鈉的有效性檢測：配制好母液400mg/L,設置6個濃度梯度，即0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L。分別吸取母液0mL、0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL于12個離心管中，每個濃度梯度設置2個樣品，后續操作與上述阿米卡星有效

38、性測試方法相同。基于PB光學方法測定抗生素有效性的原理：當有抗生素藥物存在時，大腸桿菌的呼吸受到抑制，因而產生的Fe(CN)64-少于大腸桿菌正常呼吸所產生的電子，這表明PB生成量的多少取決于抗生素對微生物呼吸的抑制程度，所以可通過肉眼觀察或利用可見光分光光度計測定吸光度以確定PB產量的減少，進而確定抗生素的有效性。不同抗生素藥物的抑制作用與E. coli的呼吸作用的關系用吸光度值變化率表示：由圖2.6.1-2.6.5可知，隨著阿米卡星，慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素和頭孢噻肟鈉5種抗生素濃度的增加，其對細菌的抑制率也在不斷增加。當達到半數抑菌率時，阿米卡星的濃度為12mg/L；慶大霉素為8m

39、g/L；左氧氟沙星為10mg/L；頭孢噻肟鈉為3mg/L。但在0mg/L-10mg/L的測量濃度范圍內，萬古霉素的抑菌率均低于40%。根據藥理作用，萬古霉素主要用于葡萄球菌（包括耐青霉素和耐新青霉素株）和難辨梭狀芽胞桿菌等致病菌所導致的疾病治療，對厭氧菌和革蘭氏陰性細菌效果并不明顯，因此對E. coli的抑制作用較其它抗生素差。可見，本文研究的基于普魯士藍的光學測試方法不僅可有效區分各種抗生素類藥物的靶向微生物，同時給出有效作用濃度。Fig2.6-1 FDifferent concentrations of amikacin inhibition rate of e. coli activit

40、y圖2.6-1 圖不同濃度的阿米卡星對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-2 Different concentrations of gentamicin inhibition rate of e. coli activity圖2.6-2 不同濃度的慶大霉素對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-3 Different concentrations of levofloxacin inhibition rate of e. coli activity圖2.6-3 不同濃度的左氧氟沙星對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-4 Different concentrations of vancomycin

41、inhibition rate of e. coli activity圖2.6-4 不同濃度的萬古霉素對大腸桿菌活性的抑制率Fig2.6-5 Different concentrations of cefotaxime sodium inhibition rate of e. coli activity圖2.6-5 不同濃度的頭孢噻肟鈉對大腸桿菌活性的抑制率3 分析和討論3.1 不同保存條件對大腸桿菌活性的影響本文通過考察保存環境和保存時間對固定菌體活性的影響確定最佳保存條件。實驗表明：經10d的保存周期，GO固定E. coli的活性隨著時間的延長，其變化幅度逐漸減小；但是隨著保存時間延長，相

42、對于PBS中保存的固體顆粒，在培養基中保存的具有表面GO結構的石墨顆粒出現了融化的現象，可能是因為載體長時間放置在有機液態環境中，受到腐蝕所致。所以在進行此實驗或在后續技術應用開發時應關注保存條件對GO固定E. coli的活性和顆粒完整度的整體影響，否則會造成結果的不準確。3.2 大腸桿菌的濃度、培養時間和普魯士藍生成量的分析與討論據研究發現，K3Fe(CN)6的濃度過高將會對細胞的呼吸產生抑制作用，使細胞膜受到損傷，所以在使用的時候應控制其濃度此外，K3Fe(CN)6的作用是接受微生物呼吸所產生的電子，需要考慮在培養時間內，其用量是否足夠。因此，根據前期實驗本文選用K3Fe(CN)6的濃度為

43、45mmol L-1。在實驗過程中，直接將同濃度的FeCl3與生成的Fe(CN)64-混合時，會產生大量的普魯士藍沉淀。經研究發現，控制FeCl3與生成的Fe(CN)64-的濃度為5mmol L-1時，生成的普魯士藍才能穩定存在，因此需要對培養液進行適當稀釋，降低Fe(CN)64-的濃度后，再添加FeCl3。同時，不同的培養時間所產生的Fe(CN)64-的濃度是不一樣的，隨著反應時間的延長，Fe(CN)64-的濃度會逐漸越大。當培養時間為1h，Fe(CN)64-的濃度較小，當加入FeCl3時，沒有出現明顯的普魯士藍；當培養時間為2h時，由微生物呼吸作用所轉移的電子增多，由此所生成的Fe(CN)

44、64-的濃度也相應增大，與FeCl3反應所生成的普魯士藍也比較明顯；當培養時間增加至3h和4h時，加入FeCl3后溶液顏色明顯加深，甚至出現了普魯士藍沉淀，因此需要提前稀釋。可見，基于GO固定E. coli光學方法的建立還應充分考慮培養時間和生成Fe(CN)64-的生成量，以確定合適的稀釋濃度。經微生物呼吸作用產生的K4Fe(CN)6不僅與培養時間有關，還與與E. coli的濃度和活性相關。本文通過建立吸光度隨E. coli在具有表面GO結構的石墨顆粒上的培養時間的關系曲線，獲得以下結論：第一，在16h之內，E. coli的活性隨著時間的增大而增大；第二，E. coli的活性達增大至一定的程度

45、后，會隨著時間的增大而減小，因為提供給菌體的營養物質和生長空間有限，同時營養物的傳導也會隨著菌體的增加而受到限制；第三，16h可作為E. coli在具有表面GO結構的石墨顆粒上固定的最佳時間，在此培養時間下，E. coli出現活性的峰值，以便于通過呼吸作用轉移更多的電子，生成更多的Fe(CN)64-，當與FeCl3反應時能夠呈現出明顯的普魯士藍，增加測定的準確度和靈敏度。4 結論通過監測 Fe(CN)64-濃度隨培養時間的變化趨勢，確定電子轉移受體K3Fe(CN)6在4h培養時間內被還原量低于45mmol/L，但加入FeCl3后會引起沉淀，因此應對培養液進行適當稀釋，保證Fe(CN)64-的濃

46、度低于5mmol/L；通過考察吸光度值隨GO固定E. coli的反應時間的變化趨勢，確定以LB培養基培養16h時，經GO固定的E. coli的活性最優；通過考察GO固定E. coli顆粒分別在LB培養基和PBS溶液中存儲周期和活性關系，確定LB培養基更適合保存固定化E. coli，且隨著存儲周期的延長，E. coli的活性損失逐漸趨于平穩。將新鮮制備的GO固定E. coli顆粒用于檢測阿米卡星，慶大霉素、左氧氟沙星、萬古霉素和頭孢噻肟鈉5種抗生素，只有萬古霉素對菌株的活性抑制較弱，其余種可用于革蘭氏陰性菌抗生素均表現出較好的抑菌作用。可見，本文所研究的基于GO固定E. coli的光學技術可有效

47、區分抗生素的靶向作用微生物和有效性；營養物質對E. coli活性的保持尤其重要，為了確保技術的靈敏度和應用性，菌體儲存過程中應注意營養物質的供給。因此，GO固定E. coli的光學技術在抗生素有效性檢測實時監測和檢測領域具有一定的應用價值。參考文獻1 曾婷, 郝麗, 謝逸欣, 等. PCR技術在細菌耐藥性中的應用研究J. 醫藥論壇雜志, 2013, 34(1): 69.2 Patel PA, Robicsek A, Grayes A, et al. Evaluation of Multiple Real-Time PCR Tests on Nasal Samples in a Large MR

48、SA Surveillance ProgramJ. American Journal of Clinical Pathology,2015,143(5):652-658.,3 Zee AVD, Roorda L, Bosman G, et al. Multi-centre evaluation of real-time multiplex PCR for detection of carbapenemase genes OXA-48,VIM,IMP,NDM and KPCJ.Bmc Infectious Diseases, 2014, 14(2): 304-313.4 戰旗, 王蕊, 李爽,

49、等. 中藥抗菌作用研究現狀J. 山東中醫雜志, 2014(8).5 楊露, 謝曉芳, 胡榮. 麻黃附子細辛湯聯合抗生素的體外抗大腸埃希菌作用研究J. 中藥與臨床, 2015, 11(3): 35-38.6 卞永娟. 呼吸道感染細菌培養及藥物敏感性試驗J. 中國現代藥物應用, 2015, 9(22): 254-255.7 孔祥菊. 某院2013年臨床分離細菌體外藥敏試驗檢測結果分析J. 醫學檢驗與臨床, 2015(5): 62-64.8 李昌勤, 趙琳, 楊宇婷, 等. 丹參生品及不同炮制品的體外抗菌活性研究J. 中成藥. 2011, 33(11): 1948-1951.9 張赟彬, 郭媛. 三

50、種方法提取八角茴香精油及其抗菌活性研究J. 德州學院學報, 2012, 28(2): 1-8.10 Lu-Ming LI, Yuan XY, Wang MY, et al. The integron-gene cassette system and the mechanism of bacterial drug resistance: research progressJ. Chinese Journal of Microecology, 2014, 26(2): 246-248.致 謝在忙碌而充實的本科實習生活快要結束的時候，首先我要把我最誠摯的謝意和最崇高的敬意送給我的實習老師劉暢副教授，

51、感謝劉老師的辛勤耕耘，你的努力讓我收獲到了知識的果實，讓我明白了知識的重量，讓我擁有了嚴謹的科研態度。在實驗的過程中也經歷過失敗，但劉老師深刻而細致的教導讓我在不斷探索中最終獲得了實驗的成功，完成了本科實習論文。其實這不僅僅是一份簡單的本科實習論文，更重要的是包含了劉老師誨人不倦的指導，所以再一次誠摯的感謝劉老師。感謝我的家人們在我本科實習階段給與我的鼓勵,關心和照顧。感謝爸爸媽媽給與我無微不至的關心與照顧，謝謝你們。感謝我的同學韓笑、孫悅、在實習實驗及論文的寫作中給予我的的熱心幫助！綜述基于微生物固定化技術的細菌耐藥性檢測方法的研究1、微生物固定化技術微生物固定化技術是20世紀發展起來的一項

52、新興技術，它利用物理或化學方法將游離微生物如真菌、細菌等限定在特定的空間內，保持生物活性并且可以多次循環使用。1.1微生物固定化隨著工農業的快速發展，環境污染問題也變得日益嚴峻，污染范圍越來越廣，因此有必要發展更加簡便、實用、高效且價廉的環境污染監測和治理的新方法。在此實際需要的基礎上，就環境污染中的水污染這一方面開啟了生物處理廢水的研究，并且已發展成為有效治理水環境污染的一大熱點。目前固定技術大致有共價結合法、吸附法、包埋法、交聯法四種。吸附法是一種傳統的微生物固定方法，利用帶電微生物與載體之間靜電的相互作用使微生物細胞固定。傳統的吸附載體包括活性炭和硅膠等物理吸附法。共價結合法是將菌體活化

53、，然后利用固定相載體表面與微生物細胞的表面功能基團（如羥基、酚羥基、咪?基、劉汲、羧基、氨基等）形成的共價鍵相結合，從而對細胞形成固定化。交聯固定法是利用多功能或雙功能試劑，直接與微生物表面的反應基團發生化學交聯，通過形成共價鍵來固定微生物，其彼此交聯形成網狀結構的固定化微生物，其結合力為共價鍵。常用的交聯試劑有三羥甲基丙烷等。包埋法是用物理方法將微生物細胞包埋在水不溶性的載體凝膠聚合物細孔的網狀空間內。它能讓產物更好的擴散，可以篩漏出雜質，還能阻止細胞的泄漏與流失。本文所使用的即是包埋法，這種方法的操作對微生物細胞的生物活性影響相對較小且操作的方法相對簡單，而且其固定微生物細胞的強度高，所以其在目前的研究中具有非常廣泛的應用。3、細菌耐藥性產生的原因和檢測方