1、精選優質文檔-傾情為你奉上糖醛酸測定方法一間羥基聯苯比色法1.原理：多聚己糖醛酸與含四硼酸鈉的硫酸溶液在高溫作用下水解, 水解產物進一步與間羥基聯苯反應, 生成粉紅色衍生物, 產生紫外吸收, 且在一定濃度范圍內, 該衍生物吸收值與糖醛酸含量呈線性關系, 可通過比色法對糖醛酸含量進行計算。2.試劑配制：間羥基聯苯溶液：稱取0.15g間羥基聯苯溶于5 mg/mL氫氧化鈉溶液中, 定容至100mL, 其質量濃度為1.5mg/mL.四硼酸鈉/硫酸溶液： 0.478g四硼酸鈉溶于100mL濃硫酸中, 備用。葡萄糖溶液：稱取葡萄糖25.00mg,加水溶解并定容至25mL混勻, 成1mg/mL的標準溶液。(

2、排除中性糖對測定結果的影響)半乳糖醛酸標準溶液：稱取干燥至恒重的半乳糖醛酸25.00 mg, 加水溶解并定容至25mL, 混勻, 成1mg/mL的標準溶液。3. 波長掃描：取半乳糖醛酸標準溶液0.50mL, 置10 mL容量瓶中, 用水定容至刻度, 搖勻( 質量濃度為0.05 mg/mL）。量取溶液1.00 mL 置于20 mL具塞試管, 置冰水浴中, 加入四硼酸鈉/硫酸溶液6 mL, 待全部加完后, 用旋渦混合器混勻, 于沸水浴中加熱5 min, 冰水浴中冷卻后用微量加樣槍加入1.5 mg/mL間羥基聯苯溶液100 L, 混勻后振搖5 min, 超聲除去氣泡。以1 mL蒸餾水同上操作制得空白

3、液調零, 用UV-2450 型紫外可見分光光度計在200 nm 800 nm波長范圍內掃描, 確定最大吸收波長。4. 標準曲線的制備：取1mg/mL 半乳糖醛酸標準溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL置于10 mL容量瓶中, 加水定容, 再分別取上述各配制溶液1.0mL至于20mL具塞試管，置冰水浴中, 加入四硼酸鈉/硫酸溶液6 mL, 待全部加完后, 用旋渦混合器混勻, 于沸水浴中加熱5 min, 冰水浴中冷卻后用微量加樣槍加入1.5 mg/mL間羥基聯苯溶液100 L, 混勻后振搖5 min, 超聲除去氣泡。以1 mL蒸餾水同上操作制得空白

4、液調零,在最大吸收波長處測定吸光度。5. 樣品測定：取樣品5 mg置100 mL容量瓶, 加水溶解定容至刻度。取溶液1.00 mL按標準曲線項方法操作。6. 中性糖影響：在一定濃度半乳糖醛酸標準溶液中, 添加不同質量的中性糖（以葡萄糖為例）, 測得加入不同質量濃度的中性糖對半乳糖醛酸溶液吸光度的影響。2 高效液相色譜法A1.標準溶液的制備： 精密稱取半乳糖醛酸對照品205. 4 mg,置50mL容量瓶中,加超純水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 mL中含半乳糖醛酸4. 108 mg) 。精密吸取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0mL置于25

5、mL容量瓶中,加超純水稀釋至刻度,搖勻,制得0.、0.、0.、0.、0.18216、0.、1.、1.、1. mg/mL的系列標準溶液。2.標準曲線的繪制： 取配制好的半乳糖醛酸系列標準溶液,分別進樣20L,按下面色譜條件測定半乳糖醛酸峰面積,以半乳糖醛酸峰面積為縱坐標, 對照品濃度(mg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線。求得回歸方程。3.色譜條件 色譜柱: Sugar-Pak (300 mm ×6. 5 mm) ,流動相: 0. 0001 mol/L EDTA水溶液,流速: 0. 6 mL /min,示差檢測器,柱溫: 90 ,示差檢測池溫度: 40 ,進樣量: 20L。理論板數:以半

6、乳糖醛酸峰計算,不得低于3000。高效液相色譜法B 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SAX 4.6×250mm 5-Micron Agilent ； 柱溫：40；流動相：0.7mol/l乙酸；流速：1.0ml/min；測定波長：示差檢測；示差檢測器溫度：40；進樣量：20L。 標準曲線的繪制：稱取古洛糖醛酸標準品，用重蒸水溶解，配制成濃度為1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的標準溶液。分別進樣10L進行HPLC測定，以峰面積為縱坐標，相應標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線進行線性回歸。 樣品處理與檢測：準確稱取300mg（精確至±0.0001）海藻

7、酸鈉或者海藻，加入72%硫酸溶液3.5mL，于研缽中研磨2h，用100mL 蒸餾水將其轉移至250mL三角瓶，100沸水浴加熱2.5h，于自來水中冷卻至室溫，加入過量BaCO3粉末，充分反應至溶液pH 為7左右，3000r/min離心，沉淀用150mL 蒸餾水洗滌3次，將上清液和洗滌液合并在一起，45真空旋轉濃縮后，定容至10mL，進樣10L進行HPLC測定。依據樣品測定的峰面積和出峰時間，在相應的標準曲線查出所測組分的量，結合所取樣品的質量和定容體積，計算出各組分的含量。三咔唑硫酸比色法（修改后）1. 原理：在硫酸中與咔唑試劑發生縮合反應，生成紫紅色化合物，其呈色強度與半乳糖醛酸含量成正比，

8、可比色定量。2. 對照品溶液的配制：精密稱取干燥至恒重的半乳糖醛酸19. 8 mg，用適量的蒸餾水溶解，并定容于100 ml 容量瓶中，配成198 g /ml 的對照品溶液。使用時稀釋至99g/ml。 四硼酸鈉-硫酸溶液的配制:精密稱取0.956 g 四硼酸鈉溶解于200 ml 濃硫酸中，超聲溶解，備用。 咔唑溶液的配制：精密稱取咔唑100 mg，溶解于100 ml無水乙醇中，配制成0.1%的咔唑溶液備用。4. 半乳糖醛酸標準曲線制備：分別精密吸取對照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml溶液置于10 ml 具塞試管中，各管加水至0.5 ml，分別在冰水浴中加入四硼酸鈉 硫酸溶液3ml，用漩渦混合器混勻，于沸水浴中加熱5 min，取出后立即冷卻至室溫，加0.1%咔唑溶液0.1 ml，搖勻，煮沸5min，冷卻至室溫后在530nm處測定其吸光度。以濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標進行線性回歸。方法學考察：精密度試驗取同