1、植物生理學(xué)報 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1: 181 收稿2010-12-02修定 2010-12-23*植物化學(xué)遺傳學(xué): 一種嶄新的植物遺傳學(xué)研究方法趙揚*中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所, 上海200032摘要:化學(xué)遺傳學(xué)(chemicalgenetics,也稱為化學(xué)基因組學(xué),chemicalgenomics研究方法是利用生物活性小分子擾動蛋白分子互作過程來研究有關(guān)的生命現(xiàn)象,是常規(guī)遺傳學(xué)研究方法的補充和延伸。化學(xué)遺傳學(xué)在植物科學(xué)中的應(yīng)用植物化學(xué)遺傳學(xué)的研究在短短幾年內(nèi),憑借其作為一種新的遺傳學(xué)研究方法所具備的獨特優(yōu)勢(如能夠克服常

2、規(guī)遺傳學(xué)研究中的遺傳冗余、突變致死難題及可提供特異強度、作用時間點上的條件性遺傳擾動等,已開始解決一些植物分子生物學(xué)中長期存在的研究難題。本文就植物化學(xué)遺傳學(xué)的一般原理及其方法,以及它作為一種新的遺傳學(xué)研究方法的優(yōu)勢及特點作一個綜述。關(guān)鍵詞:植物化學(xué)遺傳學(xué);小分子;遺傳冗余;突變致死;條件性遺傳擾動Plant Chemical Genetics: A Novel Approach to Plant Genetics ResearchesZHAO Yang *Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Bi

3、ological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, ChinaAbstract: Chemical genetics approaches, also known as chemical genomics, using biologically active smallmolecules perturb interacting proteins involved in a certain biological process of a biological subject in question.It is comp

4、lement and extension of conventional genetics approaches in term of methodology. The application of chemical genetics methods in plant sciences, termed as plant chemical genetics, in recent years, has started to answer some long time questions in this research field, because it, as a method itself,

5、has such characters and advantages in dealing with genetic problems like, genetic redundancy and genetic mutation lethality, as well as providing specific genetic perturbations in term of strength and time. This article describes the principles of plant chemical genetics including some advantages an

6、d characteristic perspectives as research approaches.Key words: plant chemical genetics; small molecule; genetic redundancy; mutation lethality; conditionally ge-netic perturbation為了研究某個生物學(xué)系統(tǒng)的功能, 一種有效的手段是設(shè)法擾動這個系統(tǒng)并觀察和分析該系統(tǒng)被擾動后的功能變化。常規(guī)遺傳學(xué)研究方法主要是利用各種變異原來擾動所研究生物體的遺傳基因, 以期獲得基因產(chǎn)物功能變異的、可穩(wěn)定遺傳的突變體, 并在此基礎(chǔ)上研究所

7、感興趣的生命過程(1-B。以生物基因水平的擾動為基礎(chǔ)的遺傳學(xué)研究方法極大地推動了我們對生物學(xué)各個領(lǐng)域的認識, 但由于生物進化歷史中經(jīng)常發(fā)生的基因組局部和整體的復(fù)制事件, 高等生物的基因廣泛地以家族形式存在, 基因家族成員的生物學(xué)功能相似而導(dǎo)致它們功能上的遺傳冗余, 這一現(xiàn)象在植物界尤為常見(Bowers 等2003; Yu 等2005。此外, 因為產(chǎn)物功能在植物生長發(fā)育中的重要性, 基因突變導(dǎo)致的遺傳突變致死現(xiàn)象也成為遺傳學(xué)研究中經(jīng)常遇到并在方法學(xué)上難以克服的難題。有機小分子能夠與生物功能蛋白互作, 并可條件性地改變蛋白的功能與活性, 因而產(chǎn)生一種可能克服遺傳冗余及遺傳突變致死等難題的新的遺傳

8、學(xué)研究手段, 被稱為化學(xué)遺傳學(xué)方法(圖1-A。化學(xué)遺傳學(xué)概念的形成可追溯到上世紀初第一次提純天然活性化合物嗎啡及提出動物細胞內(nèi)藥物受體概念(Stockwell 2000。20世紀80年代末及90年代初, 固相化學(xué)合成(solid phase synthesis(Gallop 等1994及組合化學(xué)合成(combinatorial synthesis (Gordon 等1994方法的革命性突破,使植物生理學(xué)報 2快速合成結(jié)構(gòu)多樣性的小分子有機化合物成為現(xiàn)實。而后商業(yè)用小分子化合物庫的大量出現(xiàn), 使化學(xué)遺傳學(xué)方法成為一種可行的研究方法。例如, 在較早的抗腫瘤藥物的分子機理研究中, 通過標靶鎖定的化學(xué)

9、遺傳學(xué)篩選分別找到了與腫瘤形成標靶蛋白P53及MEK1功能調(diào)節(jié)有關(guān)的生物活性小分子(Komarov 等1999; Sebolt-Leopold 等1999。有關(guān)化學(xué)遺傳學(xué)在動物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究綜述請參閱Smukst 和Stockwell (2005、Cheuk 等(2010等的文獻。植物化學(xué)遺傳學(xué)研究的歷史雖然只有10年,通過各種植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選開發(fā)出來的新型生物功能活性小分子已開始應(yīng)用于植物分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域, 一些多年來由于遺傳冗余或其他因素而進展緩慢的研究項目已開始取得了突破性的成果, 包括植物激素受體(Park 等2009、植物激素信號傳導(dǎo)(D e R y b e l 等20

10、09、植物激素功能(Tsuchiya 等2010、植物與其病原互作的分子機理(Schreiber 等2008、植物種群的自然遺傳變異(Zhao 等2007等。有關(guān)植物化學(xué)遺傳學(xué)近年來較為系統(tǒng)的綜述可參閱Hicks 和Raikhel (2009、Tóth和van der Hoorn (2010、McCourt 和Desveaux (2010等的文獻。目前, 植物化學(xué)遺傳學(xué)的研究在我國剛開始起步, 基于此, 本文擬就植物化學(xué)遺傳學(xué)研究的基本方法, 植物化學(xué)遺傳學(xué)研究手段相對于傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法的特點及優(yōu)勢做一個扼要綜述。1 植物化學(xué)遺傳學(xué)研究方法概要植物化學(xué)遺傳學(xué)研究就其方法而言通常有以下幾

11、個階段和步驟。一、選擇需要進行植物化學(xué)遺傳學(xué)研究的對象。通常的選擇包括: 植物野生型個體、植物突變個體、植物離體器官、植物培養(yǎng)細胞系、植物功能蛋白離體以及異體互作系統(tǒng)等。二、設(shè)計高通量的植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選方法,其中包括選擇高通量生物培養(yǎng)篩選模板, 如: 384孔、96孔及24孔等植物篩選培養(yǎng)模板; 建立穩(wěn)定可靠的相關(guān)生物系統(tǒng)的化學(xué)遺傳學(xué)表型及表型差異性識別手段(phenotypic readout, 例如, 生物整體水平上的生長遺傳表型、離體器官水平上的生長遺傳表型及亞細胞水平上的細胞遺傳表型等(圖2。三、篩選化合物庫的選擇, 包括化學(xué)結(jié)構(gòu)無偏向性(unbiased且結(jié)構(gòu)多樣性(diverse

12、的小分子化合物庫、生物活性功能分子集成的化合物庫以及以標靶蛋白配體(ligand類似物設(shè)計的合成化合物庫等。四、完成植物化學(xué)遺傳學(xué)初步篩選, 目的是通過已建立高通量化學(xué)遺傳學(xué)篩選的方法, 在較短的時間內(nèi), 從選定的化合物庫中篩選出一組導(dǎo)致特定生長發(fā)育遺傳表型的候選生物活性小分子。化學(xué)遺傳學(xué)初步篩選通常需要重復(fù)一次以上的實驗。五、植物化學(xué)遺傳學(xué)功能活性小分子的作用劑量測試及其在后繼分子遺傳學(xué)研究中最佳作用劑量的選定,功能活性小分子的功能結(jié)構(gòu)分析研究及圍繞該功能小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。六、植物化學(xué)遺傳學(xué)功能活性小分子的作用分子機理的研究(mode of action, 這一研究可能涉及在植物體內(nèi)該

13、功能活性小分子參與的生物學(xué)活性有關(guān)的下游基因及其蛋白產(chǎn)物: 功能活性小分子在植物細胞內(nèi)運轉(zhuǎn)蛋白及其基因, 功能活性小分子在植物細胞內(nèi)的化學(xué)修飾蛋白及其基因, 功能活性小分子在植物細胞內(nèi)的作用標靶蛋白及其基因。2 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法的特點與優(yōu)勢相對于以利用各種遺傳誘變手段使研究的生物對象產(chǎn)生特定的基因突變?yōu)榛A(chǔ)的常規(guī)遺傳學(xué)研圖1 化學(xué)遺傳學(xué)方法與常規(guī)遺傳學(xué)方法的比較Fig.1 The methodological comparison of chemical geneticsand conventional geneticsA: 化學(xué)遺傳學(xué)利用生物活性小分子來擾動生物功能蛋白, 使被擾動的生物體

14、產(chǎn)生條件性的、可逆性的遺傳表型; B: 傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法通常利用各類手段使所研究的生物基因產(chǎn)生永久性的變異,從而導(dǎo)致所研究的生物對象呈現(xiàn)永久性的遺傳變異表型。趙揚: 植物化學(xué)遺傳學(xué): 一種嶄新的植物遺傳學(xué)研究方法3究方法, 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法是利用生物活性小分子與功能蛋白的互作, 來擾動所要研究的特定蛋白的生物學(xué)功能, 并通過產(chǎn)生特定的表型來研究特定蛋白及其基因的生物學(xué)功能。化學(xué)遺傳學(xué)研究方法這一獨特的工作原理使其相較于常規(guī)遺傳學(xué)研究方法具有以下幾方面的優(yōu)勢。2.1植物化學(xué)遺傳學(xué)方法可以克服遺傳學(xué)研究中的遺傳冗余難題遺傳冗余來源于基因家族成員蛋白產(chǎn)物的功能冗余。常規(guī)遺傳學(xué)研究中利用基因誘變來對付

15、遺傳冗余的方法在遺傳學(xué)研究的實踐中往往是不可行的。例如, 通過基因誘變的方法, 我們幾乎不可能直接獲得體內(nèi)與研究有關(guān)的某個基因家族的成員基因同時被誘導(dǎo)突變的遺傳突變個體植株; 而利用單個突變個體逐一雜交的方法來創(chuàng)造同一基因家族中4個以上成員基因突變同時存在的純合個體植株, 通常也是一個難以完成的任務(wù)。相反, 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法則可篩選尋找一類生物活性小分子,它們可以作用于某個基因家族中所有成員的冗余功能區(qū), 因而可視為該基因家族中所有成員冗余功能的普遍拮抗物(general antagonist, 這類生物活性小分子可以使得該家族所有成員的生物學(xué)冗余功能同時被條件性的、可逆性的遺傳擾動(圖3-

16、A。通過植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選得到了能使擬南芥產(chǎn)生油菜素內(nèi)酯(brassinosteriod, BR組成型表達遺傳表型的生物活性小分子bikinin (De Rybel等2009。它作為ATP的功能抑制拮抗物(antagonist, 結(jié)合到BR 信號傳導(dǎo)負調(diào)節(jié)子糖原合成激酶-3 (glycogen syn-thase kinase 3, GSK3 BIN2的ATP結(jié)合功能區(qū), 阻止ATP在該區(qū)域的結(jié)合, 從而抑制BIN2的功能。由于這一作用機理, bikinin同時也能使與BIN2有同源功能的蛋白家族糖原合成酶激酶-3所有成員的去磷酸化功能受到普遍性抑制, 從而使BR信號傳導(dǎo)途徑中BIN2下游的轉(zhuǎn)

17、錄因子BES1和BZR1能保持磷酸化的活性狀態(tài), 持續(xù)地啟動下游BR信號響應(yīng)基因的活化與轉(zhuǎn)錄。從另一方面來說, 我們有可能通過植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選尋找另一類生物活性小分子, 它們可以作為某個基因家族中某特定成員特殊功能的活性類似拮抗物(agonist從而特異地遺傳擾動該成員的特殊功能(圖3-B。其中最為突出的例子是, 利用植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選, 獲得了植物激素ABA在種子萌發(fā)功能上的功能類似拮抗物pyrabactin (Zhao等2007, pyrabactin能與ABA受體家族中具有種子萌發(fā)調(diào)節(jié)特殊功能的特異受體成員PYR1互作并模仿ABA的功能抑制種子萌發(fā), 通過對pyrabactin 標靶蛋

18、白基因PYR1的克隆及功能鑒定, 以及PYR1與ABA和pyrabactin分子互作的遺傳學(xué)作用機理的研究, 發(fā)現(xiàn)了植物古老蛋白家族PYR1-PYL的一個嶄新的重要功能植物激素ABA受體(Park等2009。這一研究成果使植物學(xué)家長期尋找ABA受體家族的努力有了一個圓滿的結(jié)果, 也為ABA功能的研究開辟了廣闊的前景(Pennisi 2009; Weiner等圖2 常規(guī)的高通量植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選的內(nèi)容及流程Fig.2 The general procedures of a high throughput plant chemical genetics screen 包括小分子化合物庫的選擇、高通

19、量植物化學(xué)遺傳培養(yǎng)基制備系統(tǒng)、植物化學(xué)遺傳篩選方法的建立、高通量植物化學(xué)遺傳 表型檢測方法的建立及植物化學(xué)遺傳學(xué)表型的鑒定記錄。植物生理學(xué)報 42010。2.2 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法可以克服遺傳學(xué)研究中的突變致死難題許多重要的功能基因?qū)χ参锏纳L和發(fā)育是不可或缺的, 這些基因功能的永久性缺損將導(dǎo)致植物的幼胚死亡或生殖不育, 在這樣的情況下, 就使得利用基因誘變對其產(chǎn)物功能及植物性狀進行研究的常規(guī)遺傳學(xué)方法無法進行。使用化學(xué)遺傳學(xué)研究方法, 能夠篩選獲得一些生物活性小分子, 它們可對突變致死的重要植物功能蛋白的功能進行遺傳擾動, 有可能利用這類活性小分子對該蛋白功能進行擾動強度可控制的條件性遺傳擾

20、動, 使得能對有關(guān)的蛋白的功能進行相關(guān)研究而不會造成生物體死亡。其中一種可行的方法是, 首先利用蛋白體外互作系統(tǒng)進行相關(guān)蛋白功能的化學(xué)遺傳學(xué)篩選, 尋找對該蛋白的功能有擾動作用的化學(xué)活性小分子, 例如, 那些增強或抑制該蛋白與其互作蛋白或底物結(jié)合功能的活性化學(xué)小分子(chemical enhancer or suppressor, 而后再利用篩選到的這類活性化學(xué)小分子在植物體內(nèi)對重要功能蛋白進行有條件的、可逆性的遺傳擾動, 以此來探索該蛋白的功能, 同時又可以避免因該蛋白功能永久性缺失而導(dǎo)致的生物體死亡(圖4。2.3 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法可以提供植物生長階段特異的遺傳擾動植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選到的功

21、能活性小分子可以根據(jù)研究興趣, 用于擾動植物特殊的生長階段, 從而可以獲得對特殊植物生長階段特異蛋白在植物生長發(fā)育特定階段的表型觀測及該蛋白功能的分析研究。例如, 在擬南芥的種子萌發(fā)過程的不同時間點(階段上用同樣劑量的擬南芥上胚軸暗生長抑制活性小分子hypostatin (Zhao 等2007對其萌發(fā)種子進行處理, 將會導(dǎo)致擬南芥3天齡的暗生長幼苗呈現(xiàn)不同的上胚軸生長表型(圖5, 趙揚, 未發(fā)表結(jié)果。化學(xué)遺傳學(xué)這一研究方法上的優(yōu)勢, 為我們研究植物發(fā)育階段特異性的基因表達及功能提供了很大的方便。2.4 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法可以提供作用強度特異的遺傳擾動植物化學(xué)遺傳學(xué)篩選獲得的功能活性小分子可以根

22、據(jù)研究興趣, 用不同的劑量來處理我們研究的生物對象, 從而為我們提供了一種對研究的生物對象進行不同強度的遺傳擾動的手段。例如, 在不同濃度的hypostatin 處理條件下的擬南芥Ler 野生型暗生長幼苗, 呈現(xiàn)出不同的上胚軸及根生長表型(圖6, 趙揚, 未發(fā)表結(jié)果。化學(xué)遺傳學(xué)研究方法圖3 化學(xué)遺傳學(xué)方法克服遺傳冗余的兩種可能的分子機制Fig.3 Two possible mechanisms using chemical genetics approaches overcome the problem of genetic redundancyA: 利用化學(xué)遺傳學(xué)篩選的蛋白家族成員冗余功能的

23、普遍性活性拮抗分子來擾動蛋白家族所有成員的冗余功能, 從而可對蛋白家族冗余功能進行研究; B: 利用化學(xué)遺傳學(xué)篩選的蛋白家族特異成員特殊功能的活性競爭分子來擾動蛋白家族個別成員的特殊功能,從而可對蛋白家族特異成員的特殊功能進行研究,而繞過其家族成員的冗余功能。趙揚: 植物化學(xué)遺傳學(xué): 一種嶄新的植物遺傳學(xué)研究方法5圖4 化學(xué)遺傳學(xué)方法克服突變致死的分子機制Fig.4 Molecular mechanism of chemical genetics approaches overcomes genetic mutation lethality 利用化學(xué)遺傳學(xué)篩選到的重要功能蛋白調(diào)節(jié)小分子對該蛋白

24、功能進行條件性的、可逆性的遺傳擾動來研究該蛋白的功能, 從而避免了常規(guī)遺傳學(xué)研究方法中因基因誘變而導(dǎo)致的該蛋白功能永久性失活并造成生物死亡。圖5 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法可以提供植物生長階段特異的遺傳擾動Fig.5 Plant chemical genetics approaches provide plant growth stage specific genetic perturbation用25 µmol·L-1hypostatin分別處理Ler種子萌發(fā)過程中, 12 h及48 h的種子導(dǎo)致暗生長3天齡的Ler幼苗呈現(xiàn)不同的上胚軸表型。上的這一特點為模擬基因劑量(gene

25、dosage對植物生長發(fā)育的影響提供了一種可能的途徑。2.5植物化學(xué)遺傳學(xué)開發(fā)的生物功能小分子易于推廣應(yīng)用通常來說, 在一個生物學(xué)研究系統(tǒng)中開發(fā)出來的化學(xué)遺傳學(xué)功能小分子, 很容易應(yīng)用于其他生物學(xué)研究對象, 從而可對不同生物學(xué)系統(tǒng)以該活性小分子的擾動功能進行觀察比較研究。例如, 在模式植物擬南芥上開發(fā)出來的化學(xué)遺傳學(xué)功能小分子hypostatin可以很容易地應(yīng)用在其他模式生物如線蟲、酵母等, 觀察hypostatin對其他生物系統(tǒng)的擾動效果(圖7。化學(xué)遺傳學(xué)方法的這一特點, 一方面可以使我們用同一化學(xué)功能小分子擾動不同物種的同源基因的功能, 很方便的進行功能比較研究; 或者可以比較研究同一化學(xué)

26、功能小分子在不同生物學(xué)系統(tǒng)的標靶差異。另一方面, 如果在模式植物擬南6 植物生理學(xué)報 圖 6 植物化學(xué)遺傳學(xué)方法可以提供作用強度特異的遺傳擾動 Fig.6 Plant chemical genetics approaches provide plants strength specific genetic perturbation 在不同的 hypostatin 濃度(0,12.5 µ mol·L -1 及 25 µ mol·L -1 下暗生長 3 天齡的 Ler 苗呈現(xiàn)不同的上胚軸及根生長表型。 圖 7 化學(xué)遺傳學(xué)功能小分子易于推廣應(yīng)用 Fig.7 C

27、hemical genetics functional small molecule could be used on different biological subjects conveniently 模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)遺傳學(xué)功能小分子 hy postatin 很容易推廣應(yīng)用于其他模式生物系統(tǒng) , 如線蟲、動物癌癥細胞系、酵母。 芥中開發(fā)出來了一種能幫助植物抗逆的化學(xué)活性小 分子, 我們也很容易將其推廣到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的農(nóng)作 物上。 3 正向與反向化學(xué)遺傳學(xué)研究方法 在傳統(tǒng)遺傳學(xué)研究中, 所謂正向遺傳學(xué)研究方 法是指利用基因組隨機誘導(dǎo)突變的方法創(chuàng)造所要研 究的生物對象的遺傳突變種群 (

28、ge ne tic muta nt population, 并通過發(fā)現(xiàn)該遺傳突變種群中突變體 的突變表型, 進而來研究該變異基因或其產(chǎn)物蛋白 功能的研究方法( 圖 8-A 。與之相對的, 反向遺傳 學(xué)研究方法則是指通過變異特定基因及其產(chǎn)物蛋白 來研究某一特定基因及其產(chǎn)物蛋白的功能的研究方 趙揚: 植物化學(xué)遺傳學(xué): 一種嶄新的植物遺傳學(xué)研究方法 7 圖 8 正向與反向遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)研究方法 Fig.8 Forward and reverse genetics approaches, forward and reverse chemical genetics approaches A: 正向遺傳學(xué)研究方法流程示意 ; B: 正向化學(xué)遺傳學(xué)研究方法流程示意 ; C: 反向遺傳學(xué)研究方法流程示意 ; D: 反向化學(xué)遺傳學(xué) 研究方法流程示意。 法(圖 8-C。與正向和反向的遺傳學(xué)研究方法相對 應(yīng)的正向與反向化學(xué)遺傳學(xué)研究方法則可作如下的 描述 正向化學(xué)遺傳學(xué)研究方法是指利用化學(xué) 物庫篩選植物野生種群, 發(fā)現(xiàn)感興趣的植物化學(xué)遺 傳學(xué)表型后, 再通過有關(guān)的化學(xué)功能分子的引導(dǎo)來 發(fā)現(xiàn)其擾動的基因及其