1、1 水中隱孢子蟲和賈第蟲的檢測愛德士培訓中心Sep 27,20132流 程選 擇回收率 3兩蟲檢測全流程 樣品預處理（Sample Pretreatment）. 染色鏡檢（Staining and Microscopy）. 免疫磁分離（IMS）. 過濾. 淘洗. 離心. 4樣品預處理過濾加標實驗（QC） 10L l 采樣量5樣品預處理過濾6樣品預處理過濾l 濾芯結構過濾時水流流向淘洗時水流流向 79層多孔網狀泡沫層，兩種規格交互疊放，由790mm壓縮至30mm，螺栓固定。 濾芯兩個過濾層：外層區域為初濾器，內層濾核為選擇性濾器（此結構在提高污水樣品過濾速度的同時，保證有效地捕獲隱孢子蟲卵）。

2、淘洗時，目標微生物以反流的形式更方便地進行有效淘洗。 可處理高濁度原水。 取樣流速可達4L/min。7樣品預處理過濾l 實驗室過濾8樣品預處理過濾l 現場過濾9樣品預處理過濾l 現場過濾兩蟲移動取樣箱10樣品預處理過濾 濾器 濾芯 采樣管 水表 保溫袋 自封袋l 現場過濾兩蟲移動取樣箱11樣品預處理過濾 根據客戶需要合理設計的取樣箱。 解決現場采樣問題，并使得現場采樣操作簡便。 解決部分無兩蟲檢測設備的送樣問題。l 現場過濾兩蟲移動取樣箱12樣品預處理過濾l 現場過濾13樣品預處理過濾l 現場過濾14樣品預處理淘洗l Filta-Max Xpress兩蟲快速法淘洗設備 穩定的高回收率（大于70

3、%）。 淘洗時間90s，目前全球淘洗速度最快的設備。 一鍵操作，操作簡單。 不同樣品的結果一致性高，性能穩定。15樣品預處理離心 離心機應放在牢固的工作臺或地板上，盡量減少晃動。 離心管連同適配器一起配平，保證誤差在0.5g以內，盡量減少擺動。 離心機設定2000g離心力，工作時間15分鐘。 離心機應選用無剎車系統的（自然停止大約需7分鐘） 。 16免疫磁分離 基于細胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單抗相結合，形成抗原-抗體-磁珠免疫復合物，在外磁場中，復合物被吸附而滯留在磁場中，使其與其他物質分離。 l 定義17免疫磁分離18免疫磁分離19免疫磁分離l 試劑盒20免疫磁分離樣品量：0.5-

4、0.8ml沉淀混勻時間：1-2小時依次取下L型試管90旋轉2分鐘棄上清1XbufferA沖洗磁珠180旋轉1分鐘棄上清后酸化分離l 實驗流程21免疫磁分離l 沉淀物體積對于沉淀量小于0.5mL的樣品，直接再懸浮成10mL.對于沉淀量大于0.5mL的樣品，按照上述公式，即每0.5mL沉淀懸浮成10mL。比如，2mL沉淀應該懸浮成40mL，具體免疫磁分離過程可以取其中一分部進行。根據經驗，20L原水的沉淀量一般1-2mL；100L處理水的沉淀量一般小于0.5mL。22免疫磁分離l 結果計算如出廠水檢測出3個隱孢子蟲，帶入共計進行計算： Y=（310mL)/(10mL100L)=0.03個/L如原水

5、沉淀量2mL，懸浮成40mL，免疫磁分離取了其中10mL，檢出3個隱孢子蟲，帶入并計算： Y=（340mL)/(10mL20L)=0.6個/L23染色鏡檢l 染色試劑盒 單克隆熒光抗體染色試劑 復染液 封固劑 DAPI染色試劑 陽參 1倍洗脫緩沖液24染色鏡檢l 異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發射光波長為525530nm，呈現明亮的黃綠色熒光。FITC是在熒光素的基礎上通過化學反應增加硫氰酸基團得到的，硫氰酸基團可以和生物活性物質，例如蛋白質上的伯胺基團反應形成硫脲鍵，從而實現對生物

6、活性物質的熒光標記。能和各種抗體蛋白結合，結合后的抗體不喪失與一定抗原結合的特異性，并在堿性溶液中具有強烈的黃綠色熒光。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可對相應抗原進行定性、定位或定量的檢測。儲存條件：4避光保存。25染色鏡檢l 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)一種能夠與DNA強力結合的熒光染料，常用與熒光顯微鏡觀測。因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發。當DAPI與雙股DNA結合時，最大吸收波長為358nm，最大發射波長為461nm

7、，其發散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。能快速進入活細胞中與DNA結合，因此DAPI對生物體而言，也被視為一種毒性物質與致癌物。使用過程中應注意操作與拋棄的處理程序。26染色鏡檢l 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)濃度2mg/mL，用時需要5000倍稀釋，現用現配。27染色鏡檢l 鏡檢28染色鏡檢l 兩蟲孢囊與卵囊特征賈第蟲孢囊 外形：卵形或橢圓形 直徑：11-14um29染色鏡檢l 兩蟲孢囊與卵囊特征隱孢子蟲卵囊 外形：類似球 直徑：4-6um30染色鏡檢l 兩蟲孢囊與卵囊特征 蘋果綠外殼：充要條件 大小和形狀31染色鏡檢FI

8、TC染色DAPI染色DIC觀察32染色鏡檢33染色鏡檢34染色鏡檢35如何提高回收率l 采用商售PBS淘洗液試劑品牌貨號l PBSSigmaP4417-50TABl NaOHFluka38215-1EA-Rl HClFluka35335-1Ll Tween20SigmaP7949-100ML36如何提高回收率l 采用商售HCL和NaOH試劑，或標配所需酸堿37如何提高回收率l 對容器和管子進行潤洗 使用0.05%的吐溫20或者吐溫80，對于樣品接觸的所有容器都進行潤洗，將潤洗的液體也加入樣品。38如何提高回收率l 離心后，謹慎去除上清液 可采取虹吸，棄去上清。管子上插上槍頭，使得震動最小。39

9、如何提高回收率l 謹慎清洗玻片 隱孢子蟲和賈第蟲可能在染色過程被沖走，為了避免此情況發生，請輕輕的移走玻片上的液體。40如何提高回收率l 玻片干燥過程可影響回收率 IMS過程中的酸如果沒有有效中和可以破壞賈第蟲的孢囊外表，引起賈第蟲染色過程中的變化。這可以導致鏡檢過程中賈第蟲的漏檢。快速將樣品干燥以及冷藏樣品可以保證賈第蟲的表面不受損壞 。 為了優化此步驟，確保樣品一旦中和后，快速在37條件下干燥（最長干燥時間1小時），并立即染色。 如果IMS中和后需要延遲染色，需要快速在37干燥玻片后立即放入冰箱冷藏過夜。否則，需要在標準的家用冰箱冷藏過夜。在冷室中干燥玻片可能由于濕度環境使得玻片不易干燥。

10、41如何提高回收率l 免疫磁分離對于一些水樣，很大一部分的隱孢子蟲和賈第蟲可能會遺漏在IMS磁珠上，在酸化過程中沒有得到回收。此時進行二次酸化可以有效提高回收率。IMS分離過程中，二次酸化分離非常有用。對于回收率比較低沒有滿足回收率標準的樣品，可以將其IMS過程廢棄的上清液進行收集，對這些廢液再次進行免疫磁分離過程，以滿足回收率。可以將廢液收集到免疫磁分離之前用的 50mL的離心管中，這可以避免錯誤的標記樣品，你可以分辨哪個樣品具有較低的回收率然后做一個二次的免疫磁分離。非常多的干擾免疫磁分離的物質在第一次免疫磁分離過程中都被去除掉了，所以第二輪免疫磁分離回收率可能會戲劇性的更高。42如何提高回收率l 可中斷的