1、中藥肝復健沖劑對大鼠肝纖維化形成的影響作者：錢妍凌昌全時間：2007-11-22 11:04:00 【關鍵詞】 膠原Influence of Ganfujian granule formula on process of liver fibrosis in rat【Abstract】 AIM: To investigate the effect of ganfujian granule on collagen sediment in rat hepatic fibrosis induced by diethylnitrosamine (DEN). METHODS: DEN induced li

2、ve fibrosis model was established and ganfujian (GFJ) granule was administrated as intervention measure. Influence (EFJ group) of ganfujian granule on collagen sediment and hepatocyte proliferation were examined by Picric acidSirus red staining and immunohistochemical staing methods, and analyzed by

3、 computer image analysis technique. RESULTS: Collagen sediment in rat liver increased gradually with the exacerbation of hepatic fibrosis in the model. Inflammatory damage and the degree of liver cirrhosis were lower GFJ group than in model group. Collagen sediment in liver and positive expression o

4、f proliferotive cell number ontgen (PCNA) in hepatocytes were decreased significantly in GFJ group (collagen sediment: 4 wk （15.202.21）vs（7.190.97）;12 wk （27.14.6）vs （16.01.7）. positive expression of PCNA in hepatocytes: 12 wk （21.10.32） vs （6.40.2）; 16 wk（31.17.1）vs（10.10.8） (P0.05). CONCLUSION: GF

5、J granule can inhibit and retard rats liver fibrosis by reduce collagen sediment in rat liver and may prevent liver cirrhosis transit to hepatocarcinoma in some degree by inhibit overproliferating of hepatocytes.【Keywords】ganfujian granule; traditional medicine; liver cirrhosis; collagen【摘要】 目的： 觀測中

6、藥肝復健沖劑對二乙基亞硝胺（DEN）誘導大鼠肝纖維化形成的影響. 方法： 建立DEN誘導大鼠肝硬化模型，同時給予肝復健沖劑進行干預，應用天狼紅苦味酸特染法、免疫組化染色法及計算機圖像分析技術檢測中藥對DEN致大鼠肝纖維化過程膠原沉淀及肝細胞增殖特性的影響. 結果： 隨著模型大鼠肝纖維化程度加重，肝內膠原沉積量亦呈逐漸增加趨勢. 中藥組大鼠肝臟炎性損害及肝纖維化程度均較同期模型組大鼠輕，膠原沉積量及細胞增殖核抗原(PCNA)陽性著色肝細胞數(shù)明顯減少，兩組間差異有統(tǒng)計學意義, P0.05膠原沉積量：4 wk（15.202.21）vs （7.190.97）; 12 wk（27.14.6） vs （1

7、6.01.7）. 陽性表達PCNA肝細胞數(shù)：12 wk（21.10.32） vs （6.40.2）;16 wk（31.17.1）vs （10.10.8）. 結論： 中藥肝復健沖劑可通過減少肝內膠原沉積及可能惡性增殖的肝細胞，抑制和延緩實驗性動物肝纖維化的形成，并一定程度上預防肝硬化向肝癌的轉變.【關鍵詞】 肝復健沖劑；肝硬化；膠原0引言HBV感染患者和幾乎全部HCV攜帶者有可能發(fā)展為肝硬化，亦是造成肝硬化發(fā)病率居高不下的主要原因，而肝硬化中約30%患者可并發(fā)肝癌1. AFP升高、肝硬化伴細胞不典型增生或細胞增殖活性增高成為肝癌發(fā)病的高危因素2，因而慢性肝病、肝硬化的防治十分重要. 如何延緩肝纖

8、維化形成進程或逆轉至正常，已成為肝硬化及肝癌防治的中心問題. 因此，研制有效且可長期服用的預防制劑也越來越引起人們的關注. 健脾扶正法是中醫(yī)臨床防治肝硬化與肝癌常用的方法之一3. 本科室根據(jù)中醫(yī)基礎理論及臨床實踐研制的以健脾益氣立法，由淮山藥、山楂、大棗等藥食同源中藥組成的肝復健沖劑，在臨床肝硬化防治過程中取得較好療效.1材料和方法1.1材料SD雄性大鼠，體質量150180 g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供. 二乙基亞硝胺(DEN)購自Sigma公司. 天狼紅（解放軍第475醫(yī)院贈送）. PCNA檢測試劑盒購自DAKO公司. 中藥飼料：肝復健沖劑按30.4 gkg-1均勻混合于基礎飼料中壓制

9、而成（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供）.1.2方法統(tǒng)計學處理：采用SPSS統(tǒng)計分析軟件對所獲得的數(shù)據(jù)進行組間秩和檢驗.2結果2.1大鼠肝纖維化過程組織形態(tài)學變化模型組大鼠使用DEN 48 wk時肝表面由平滑逐漸變?yōu)榇植冢梢娦☆w粒，呈局灶性. 光鏡下肝細胞腫脹，空泡變性，局灶性壞死，伴炎細胞浸潤，并逐漸出現(xiàn)纖維組織增生. 12 wk時40%大鼠已出現(xiàn)明顯肝硬化，肝表面更加粗糙，肝臟增大、腫脹，色暗或淡. 16 wk時大鼠均有肝硬化表現(xiàn)，結節(jié)增多變大，肝臟縮小，組織學有大量形態(tài)不一，大小排列不齊的假小葉形成. 部分大鼠肝臟已出現(xiàn)早期癌結節(jié)，鏡下可見少量癌細胞增生. 中藥組大鼠各時期肝臟損害均較單純

10、誘導組輕，12 wk無肝硬化大鼠，16 wk 50%大鼠出現(xiàn)肝硬化，但未發(fā)現(xiàn)癌變.2.2大鼠肝纖維化過程肝內膠原沉積變化模型組大鼠4 wk肝內即出現(xiàn)少量紅色膠原陽性染色，多集中于匯管區(qū). 隨著肝內病變加重，假小葉的形成，肝臟沉積的膠原逐漸增多， 16 wk病變以結節(jié)性肝硬化為主，切片膠原沉積量亦達到頂峰. 中藥組大鼠肝內病變較模型組明顯減輕，肝硬化發(fā)生晚，肝內膠原沉積量少，在4 wk及12 wk兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05, Tab 1). 表1兩組大鼠肝臟膠原沉積的比較(略)2.3大鼠肝纖維化過程肝細胞陽性表達PCNA情況在模型初期即可見少量肝細胞PCNA陽性著色，隨著模型進展，大鼠肝

11、臟PCNA陽性表達的肝細胞數(shù)目逐漸增加，并在1216 wk呈明顯攀升趨勢. 中藥組大鼠PCNA陽性的肝細胞數(shù)在各期均低于模型組，其中1216 wk差異顯著(P0.05, Tab 2). 表2大鼠肝細胞陽性表達PCNA的比較(略)3討論肝纖維化是許多慢性肝病重要的中間環(huán)節(jié)，是由于肝內纖維生成與降解失衡，致使過多的膠原在肝內沉積，常伴于炎癥并可發(fā)展為肝硬化. 肝纖維化形成作為肝硬化發(fā)展過程中的一個重要現(xiàn)象，與肝硬變的發(fā)展是平行的5,因此肝纖維化程度的精確了解是慢性肝病研究不可少的. 然而常用的血清學指標和組織學纖維化分級標準卻難以直接、準確反映肝臟內膠原沉積變化. 本文采用切片膠原圖像定量處理方法

12、具有準確、客觀、數(shù)據(jù)可信度高等特點，能精確反映肝內膠原沉積（主要為I, III型膠原）變化4. 本實驗中應用該法檢測DEN誘導大鼠肝纖維化過程中肝內膠原沉積的變化，結果顯示隨著肝細胞變性、炎癥高峰到橋接性壞死、肝硬化形成，肝臟形態(tài)學改變與膠原沉積呈同步變化.細胞的異常增殖是癌變發(fā)生的主要特征. PCNA是一種從細胞核中分離純化出來的多肽鏈，直接參與細胞增殖過程中的DNA復制，其含量和陽性表達是反應G1晚期和S早期肝細胞增殖的常用指標6-8. 在本模型中初期即出現(xiàn)少量肝細胞PCNA陽性著色，而隨著模型進展，尤其在1216 wk（肝硬化期）PCNA陽性肝細胞數(shù)明顯增加，與肝內病變進展呈一致變化.

13、即隨著肝硬化的形成，異常增殖肝細胞數(shù)目呈明顯增加趨勢，提示從肝臟炎性改變、肝纖維化至肝硬化的形成，異常增殖的肝細胞數(shù)目不斷增加，癌變的可能性亦逐漸增加.近年來中醫(yī)藥防治肝纖維化取得了不少進展，也積累了豐富的經驗，從單味藥、復方及其有效成份等入手，初步發(fā)現(xiàn)活血化瘀與扶正補虛兩類中藥具有良好的防治肝纖維化作用. 由于采用中草藥治療慢性肝病在臨床上有肯定療效，且又具有無明顯毒性反應或副作用的優(yōu)點，因此，是防治肝纖維化較有希望的治療手段，已引起國內外肝病研究人員的極大興趣9. 健脾扶正法是防治肝硬化與肝癌最常用的方法之一，曾證明對肝硬化和DEN致大鼠肝癌前病變的發(fā)生可能有一定的預防作用10-12. 肝

14、復健沖劑以健脾益氣立法，組方均為藥食同源中藥，具有低毒、可長期服用的特點. 本實驗結果顯示該沖劑可明顯減少肝內膠原沉積，延緩化學致癌物DEN所致大鼠肝纖維化過程，同時對肝硬化形成期陽性表達PCNA的肝細胞數(shù)目亦有顯著抑制作用. 提示該沖劑可通過減輕化學物質引起的肝內炎性病變，減少肝內以I、III型為主的膠原沉積，延緩和減輕肝纖維化過程，同時可抑制肝硬化形成及演變期肝細胞可能的惡性增殖，達到阻抑肝硬化形成及其繼續(xù)發(fā)展為肝癌的作用.【參考文獻】1 Wang J, Wang N. Hepatic fibrosis and medical treatment J. Guowai Yixue Waike

15、 Fence (Fore Med Sci), 2001; 28(1): 27-29.2 Wang QH, Liu XF. Study on monitoring of high risk populations of liver cancer J. Guowai Yixue Zhongliu Fence (Fore Med Sci), 2002; 29(6): 449-451.3 Wang WQ. Study on effect of TCM on hepatic fibrosis J. Shandong Zhongyiyao Daxue Xuebao (J Shandong Univ of

16、TCM), 2003;27(1): 75-78.4Wang GY, Cai WM, Wang JQ. Experimental study of histological quantitative method in diagnosing hepatic fibrosis J. Zhongxiyi Jiehe Ganzangbing Zazhi (Com chin and west J Hepato), 1999;9(1):26-28.5Hepatic Fibrosis study Group of Chinese liver diseases Association. Consensus o

17、n evaluation of the diagnosis and efficacy of hepatic fibrosis J. Zhonghua Ganzangbing Zazhi (Chin J Hepato), 2002;10(5):327-329.6 Lu S, Zhan AH, Huang XX. Ren YJ. Expression and significance of proliferating cell nuclear antigen in resistance of lithium carbonate to Aflatoxin B1 induced hepatocarci

18、nogenesis in rats J. Aibian Tubian Jibian (Carci Tera Mut), 2002; 14(2): 84-86.7 Wei W, Gong JP, Qiu FZ. Relationship between cell proliferation and apoptosis during the normal and abnormal liver tissue prolferation J. Zhongguo shiyan waikexue Zazhi (Chin J Exp Surg), 2001; 18(2): 156-158.8 Zhang XL

19、, Shi JQ. Quantitative study on morphologic features and prolifertive activity during DEN induced hepatocarcinogenesis in rats J. ACTA, 2001; 23(3)：304-307.9 Ji G, Cao CL, Liu P, Hu WY, Liu C. Pathology and immunochemistry research on effects of FuzhengHuayu prescription on hepatocyte proliferation of cirrhosis rats J. Zhongguo Zhongyi Jichu Yixue Zazhi (Chin J Bas Med TCM), 2001;7(2): 29-32.10 Zhu B, Liu DW, Fang WL, Yang X. Effect of antifibrosis herbs on