1、水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 王躍星,吳昆,方云霞陳紅旗倪深付向東朱旭東,(中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室,杭州;中國科學院遺傳與發育生物學研究所,北京;共同第一作者;通訊聯系人,Email:ricezxdcom)GeneticAnalysis,GeneMappingandBreedingApplicationofSmallGrainandDensePanicleMutantsepinRiceWANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,CHENHongqi,NIShen,FUXiangdong,ZHUXudong,(StateKeyLaborat

2、oryofRiceBiology,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou,China;InstituteofGeneticsandDevelopingBiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,China;Theseauthorscontributedequallytothispaper;Correspondingauthor,Email:ricezxdcom)WANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,etalGeneticanalysis,genemappingandbreedingappl

3、icationofsmallgrainanddensepaniclemutantsepinriceChinJRiceSci,():Abstract:ByCorrayradiation,asmallgrainanddensepaniclemutantsepwasobtainedfromtheindicavarietyShuangkezaoComparedtothewildtypeShuangkezao,itwasamutantwithsmallergrain,shorterspikestalkbutmoregrainnumberperpanicleThehistologicalsliceobse

4、rvationofthemainstemshowedthatthemutanthadmorevascularbundlenumberinonecycleandmorecellnumberperunitareathanthewildtypeGeneticandallelismanalysisresultsshowedthatthesmallgrainanddensepaniclemutantwascontrolledbyarecessivegene,anditwasdifferenttothedensepaniclegeneswhichhadbeenalreadyclonedThenbycons

5、tructingthegeneticsegregatedpopulationandusingtheInDelmarkers,thesmallgrainanddensepaniclegenewasmappedonthecentromericregionofchromosomebetweenmarkerXPandXPInaddition,thebreedingapplicationofthemutantwascarriedoutonCMSlinesandthestabilelinesofhighgenerationshadfinallybeenobtainedKeywords:rice;small

6、grainanddensepanicle;geneticanalysis;genemapping;breedingapplication王躍星,吳昆,方云霞,等水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用中國水稻科學,():摘要:通過Co衰變產生的r射線輻照秈稻品種“雙科早”,獲得小粒密穗突變體sep,該突變體與野生型雙科早相比表現為籽粒變小,穗軸變短,著粒密度增加.主莖切片觀察結果顯示,突變體維管束數和單位面積細胞數均比野生型多.遺傳分析和等位性分析結果表明,該突變體為隱性突變,與已克隆的直立密穗基因不等位.利用InDel分子標記將小粒密穗基因sep定位在第染色體著絲粒附近的兩個標

7、記XP與XP之間,物理距離約為Mb.此外,還利用該突變體開展了相應的育種利用研究,已獲得高代穩定的不育系材料.關鍵詞:水稻;小粒密穗;遺傳分析;基因定位;育種利用中圖分類號:Q;S文獻標識碼:A文章編號:()禾谷類作物穗的構成主要包括籽粒大小和穗的形態,二者直接決定最終的產量.穗型是水稻育種上一個重要的農藝性狀,其主要由一次和二次枝梗的形態、數量和長度決定.粒形和穗型作為水稻理想株型的重要性狀,對于水稻產量增加起到了至關重要的作用,已受到越來越多育種家的重視.國內外已有報道發現并完成定位克隆的直立密穗基因有DEP(qPE)、DEP(EP)、DEP和EP等.這些基因大多來自粳稻品種或品系.其中,

8、DEP位點是一個控制水稻產量性狀的主效QTL,該位點在品種馴化過程中發生突變,產生的dep能導致稻穗變短、直立、著粒密集.dep收稿日期:;修改稿收到日期:.基金項目:浙江省自然科學基金資助項目(YC);國家計劃資助項目(CBA).中國水稻科學(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn是一個來自中花和日本晴的直立密穗突變體.DEP編碼一個目前功能未知的植物特有蛋白,主要在幼嫩組織(尤其幼穗)中表達.形態和表達分析表明DEP主要影響穗軸和一、二次枝梗的伸長,但并不減弱穗原基的分化和形成.DEP與小圓粒基因srs和EP為等位基因.dep也來自粳稻,

9、其穗從開花到完熟都保持直立狀態,與野生型稻穗在花后就開始下垂的形狀明顯不同.此外,dep突變體的穗長、粒形以及每穗粒數等性狀也發生改變.與野生型相比,dep突變體的維管束更小、莖更粗,這解釋了穗直立的表型.EP是使用N甲基N亞硝基脲處理粳稻品種Hwasunchalbyeo,獲得一個直立穗突變體hep,遺傳分析表明該表型受一個隱型突變基因ep控制.ep突變顯著增加了小維管束的數量和穗軸的粗壯度,這是產生直立穗表型的原因.本研究通過r射線輻照秈稻品種“雙科早”獲得了份小粒密穗突變體sep(smallgrainanddensepanicle,sep).本研究對該突變體的表型、生理特征以及主要農藝性狀

10、進行了觀察,并對sep進行遺傳分析和基因定位,為該基因的克隆、功能分析奠定基礎.同時,開展了sep在不育系育種中的應用,以期利用該突變等位基因來培育優質高產小粒不育系,起到提高制種效率和節本增效的作用.材料與方法供試材料利用Co衰變產生的r射線輻照秈稻品種“雙科早”,獲得了大量的形態突變體.其中,sep突變體表現為小粒和密穗性狀.于和年將sep突變體與野生型種植于中國水稻研究所富陽試驗基地,成熟期調查株的株高、穗長、結實率、粒長和粒寬等農藝性狀,取平均值.突變體的遺傳分析與育種利用突變體基因遺傳分析群體為sep與粳稻品種日本晴、美國品種L的F及F群體,配置正、反交.利用sep與光舒(直立穗粳稻

11、)雜交考查其與已經定位基因DEP的等位性關系;利用sep與日本晴的F群體中小粒密穗分離單株對突變體基因開展定位研究.將sep與華粳秈、稻花香號、中B和中巧B等配組,獲得育種利用群體(F,F和回交群體等).對上述各世代材料實行單本移栽,逐株考查單株表型分離情況,在考查直立密穗突變體的同時考查分析直立密穗突變體后代分離的遺傳特點.突變體組織切片觀察取野生型和突變體的莖稈用FAA固定液固定、保存.石蠟切片制作方法參見文獻.突變體的基因定位親本、F及F遺傳群體植株的基因組DNA采用CTAB法提取.通過NCBI(http:/wwwncbinlmnihgov)公布的粳稻日本晴和秈稻的全基因組序列差異尋找插

12、入/缺失(InDel)位點,利用PrimerPremiers軟件設計InDel分子標記(表,引物由上海英俊生物技術有限公司合成).將提取的DNA用于PCR擴增實驗,PCR體系如下:DNAL,正反向引物(mol/L)各L,表本研究中用于定位的分子標記TableMolecularmarkersformappinginthestudy標記Marker正向引物序列Forwardprimersequence()反向引物序列Reverseprimersequence()物理位置Physicalposition/bpXPCCACCGAAACATAAACATCATCTGGGTTTGTGAATTGAGAATXP

13、AAAGCCACCTAATAGAATCAAACCATTTGGAGCGGATAGTCXPTACGAAATGGACAAGATAGCACGCTTACTTTCTTCTGGGTGATAXPGCTTCAAAACAATCATCATATCAGTCAAAACGTAGGTACTTCAGXPAAATTGGTTCGTCGCTGGTTAAAACGGAAAACCAAGGGGAAAXPAATAGTTATTCTAGGGGAGGGGCCATTTCATTCCATTTTCATACTXPGCCAAAGAATCCAGCACCCCTTTTCGTTCCCCACCATCCACXPCTCCCTTCCATCGCCACAATCCAAACTCGAA

14、ACCGACAAAXPGATAACCGTGCTGTCTCCCCCGCGATACGTTTGTACACCGXPGGATCGAAAGAAACAAAATAGTAGTCCCACGTAAATACAGAAACXPTCCAGGTGATAAGAAAGTGAATGAATGTTGAGTGGTATGCGATGA中國水稻科學(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)表雙科早及其突變體sep株高和穗相關性狀TableComparisonofplantheightandpanicletraitsbetweenShuangkezaoandthemutantsep材料Material株高Plantheight/cm穗長Pan

15、iclelength/cm每穗粒數Noofgrainsperpanicle結實率Seedsettingrate/粒長Grainlength/mm粒寬Grainwidth/mm雙科早Shuangkezao±±±±±±sep±±±±±±和兩年數據平均.和分別表示野生型與突變體在和水平上差異顯著.Valuesaremeansofandandmeandifferencebetweenwildtypeandthemutantatandsignificancelevel,respecti

16、vely表sep與L、日本晴組合F分離的卡方檢驗TableTestofchisquareonsegregationrateofFpopulationbetweensepandL,Nipponbare組合Combination正常表型株數Normalpanicleplantnumber突變表型株數Mutantplantnumber總株數Totalplantnumber分離比例Segregationratio卡平方檢驗Chisquaretestsep/L,Psep/日本晴sep/Nipponbare,PdNTPs(mol/L)L,×PCR緩沖液L,Taq酶L,加ddHO補足L.PCR程序

17、如下:下預變性min;下s,下s,下s,個循環.PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳,電泳結束后在凝膠成像儀拍照并讀膠.統計分析采用MicrosoftExcel軟件進行數據統計,用SAS軟件進行方差分析.結果與分析突變體的表型鑒定小粒密穗突變體sep與野生型雙科早相比,表現為籽粒變小,穗型變短,著粒密度增加,植株變矮(圖).此外,生育期、分蘗數、結實率等性狀無明顯差異,其小粒密穗性狀能穩定遺傳.突變體sep與野生型雙科早株高及穗部考種數據見表.突變體的顯微結構從野生型雙科早和小粒密穗突變體sep的成熟植株主莖進行切片(圖)可以觀察到,不論是主莖橫切面還是縱切面,野生型植株主莖細胞均比突變體略大,突

18、變體細胞排列更緊密,細胞數量更多.突變體主莖橫切面維管束數量(圖C)顯著多于野生型;縱切面單位面積細胞數量(圖F)也顯著多于野生型.這一結果說明突變體植株整體細胞數量增多,排列更緊密,且細胞橫向發展明顯,從而造成圖雙科早與突變體sep的表型比較FigComparisonofplants,paniclesandgrainsofShuangkezao(SKZ)andsep了株高降低,同時也構成了突變體每穗粒數顯著增加的組織結構基礎.突變體的遺傳分析及基因定位在sep與L、日本晴等配組后,雜交F均表現為正常表型,F穗型發生分離,遺傳比例符合正常表型突變表型(表),表明sep小粒密穗突變表型受單隱性核

19、基因控制.王躍星等:水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 A雙科早橫切;Bsep橫切;C橫切面維管束數量;D雙科早縱切;Esep縱切;F縱切面虛線框面積中細胞數.A,CrosssectionofShuangkezao;B,Crosssectionofsep;C,Statisticcomparisonofvascularbundlenumberinonecycle;D,LongitudinalsectionofShuangkezao;E,Longitudinalsectionofsep;F,Cellnumberinthedottedbox圖雙科早和突變體sep莖的顯微結構比較F

20、igMicroscopicstructurecomparisonbetweenShuangkezaoandsep圖sep基因在第染色體上位置FigLocationoftheseponChromosome將突變體sep分別與攜dep基因的光舒雜交,進行等位性檢測,結果表明sep基因與dep不等位,為新的小粒密穗基因.利用本實驗室均勻分布于條染色體的對公共引物對sep/日本晴的F分離群體進行連鎖分析,初步確定目標基因位于第染色體著絲粒附近,介于InDel標記XP與標記XP之間的約Mb區間內,在該區域還未有相關基因的報道.進一步在連鎖標記附近開發了對存在多態的InDel標記(表),利用這些標記以株分

21、離單株為材料對突變體基因進行進一步的定位,最終將sep定位于著絲粒附近的InDel標記XP與標記XP之間約Mb的區間內(圖).突變體sep的育種利用對突變體sep與華粳秈、稻花香號、中B的分離世代重點選擇小粒密穗、異交習性好、米質優異的單株,用相應的輪回親本進行連續回交,在中國水稻科學(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)HJX華粳秈;DHX稻花香號.HJX,Huajingxian;DHX,Daohuaxiang圖NILsep(sep/華粳秈后代株系)、NILsep(sep/稻花香號后代株系)與親本籽粒、株高及穗部性狀比較FigComparisonofgrain,plantheighta

22、ndpanicletraitsbetweenHJXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/HJX),DHXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/DHX)選擇突變性狀同時,兼顧選擇系內株間較整齊、花時較早、柱頭外露的單株,年分別從sep/華粳秈組合和sep/稻花香號組合獲得了穩定不育系NILsep和NILsep.NILsep和NILsep與各自輪回親本籽粒相比(圖),它們的穗長變短,籽粒變小,植株變矮,但著粒密度增加.討論目前在我國長江中下游地區和東北遼寧省、吉林省的部分稻區種植的直立和半直立穗型的高產粳稻品種都含有DEP突變

23、基因,表明DEP已在我國水稻增產中發揮了關鍵作用.大量粳型密穗品種的推廣種植實踐表明,密穗型品種植株細胞縱向縮短、橫向變長,細胞數目也同時增多,表現為株高降低,莖桿更粗壯,穗型直立,著粒密度增加,最終也能達到穩產高產的理想狀態.從群體光能利用效率抗倒伏能力來看,密穗型品種也具有一定的形態優勢.研究者利用r射線輻照秈稻品種雙科早時獲得了大量的形態突變體,其中共有份密穗型突變體,分別編號為SKZ、SKZ、SKZ(sep)、SKZ和SKZ.雜交等位性分析和基因定位結果表明,突變體SKZ、SKZ、SKZ密穗性狀控制基因與已克隆基因DEP等位,基因定位結果均位于號染色體相同位置;突變體SKZ密穗性狀控制

24、基因和DEP、DEP、DEP都不等位(該突變體基因的定位工作正在進行中);突變體SKZ(sep)密穗性狀控制基因與DEP、DEP、DEP均不等位,且sep和SKZ密穗性狀控制基因間不等位.與其他份突變體相比,sep不但同時表現出典型的小粒密穗,且結實率等性狀均未出現明顯下降(表),因此首先針對該材料開展遺傳分析,基因定位和育種利用的工作.在雜交稻不育系選育中,為求得到更高的雜交水稻產量潛力,提高千粒重是現行采用的手段之一,但這也同時導致了稻農用種量的增加而投入更多用于購種的成本,.以往推廣的不育系中大多為大粒品種,如龍特甫A、A和內香A等,只有極少數小粒不育系如博白A,而且也僅局限在兩廣(廣東

25、和廣西)地區推廣較多.另一方面,雜交水稻種子生產成本逐年升高,直接導致了雜交種的價格的快速上漲.年雜交水稻種子市場價格總體比年上漲了;年雜交水稻種王躍星等:水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 子價格比年上漲了,其中部分市場主導品種價格上漲幅度遠大于全國平均漲幅,甚至有少數品種價格漲幅超過;年全國三系雜交稻均價元/kg,同比上漲,兩系雜交中稻均價元/kg,同比上漲.因此,如何提高制種效率,降低制種成本,達到節本增效的同時,減輕農民購種負擔,是一個急需解決的問題.通過小粒密穗突變體sep的發掘和利用,可以將隱性的小粒密穗基因導入不育系,使籽粒變小同時每穗粒數增加,這樣在相同制種

26、面積下,可產出更多粒數的雜交稻種子,而在雜交稻F代,該隱性性狀又不會出現,從而不改變雜交稻生產出的谷粒大小,保持高產農藝性狀,最終減少制種面積,提高土地利用效率,降低種子公司制種成本,減少稻農購種的成本,增加稻農的收益.在雜交水稻種子快速上漲的背景下,這不失為一個有效的策略.當然小粒不育系種子在發芽率,發芽勢上,以及葉期前幼苗養分供給方面,與大粒品種間是否存在差異,如何在育種實踐和生產中真正開展運用還有待進一步研究和探討.參考文獻:HuangXZ,QianQ,LiuZB,etalNaturalvariationattheDEPlocusenhancesgrainyieldinriceNatGe

27、net,():YanCJ,ZhouH,YanS,etalIdentificationandcharacterizationofamajorQTLresponsibleforerectpanicletraitinjaponicarice(OryzasativaL)TheorApplGenet,():ZhouY,ZhuJY,LiZY,etalDeletioninaquantitativetraitgeneqPEassociatedwithpanicleerectnessimprovesplantarchitectureduringricedomesticationGenetics,():FumioTS,YasushiK,HiroshiK,etalAlossoffunctionmutationofricedensepaniclecausessemidwarfnessandslightlyincreasednumberofspikeletsBreedingSci,():LiF,LiuWB,TangJY,etalRicedenseanderectpanicleisessentialfordetermin