1、發酵法生產 L 谷氨酰胺研究進展 L-谷氨酰胺(L-glutamine, L-Gln)是 L-谷氨酸的 - 羧基酰胺化的一種條件性必需氨基酸(圖 1),相對分子質 量 146.15,熔點 185(分解),晶體呈白色斜方或粉末 狀,結晶狀態下穩定,無臭,稍有甜味,溶于水( 水 溶液呈酸性) ,等電點 5 . 6 5 ,幾乎不溶于乙醇和乙醚. L-Gln 屬中性氨基酸,在偏酸,偏堿及較高溫度下易分 解成谷氨酸或環化為吡咯烷酮二羧酸.O H 2N C CH2 CH2 N H 3+ CH COO-L-Gln是人體血液中濃度最高(500900 mol/L)的游 離氨基酸,所占比例高達 61%.

2、L-Gln 在腎臟是腎小管 泌氨作用的主要氮源,在肝臟是糖異生和尿素合成的原 料,在神經組織又是神經遞質的前體物質,在血液中 有暫時解除氨毒的作用,現已普遍認為 L - G l n 是一種 "條件性必需"氨基酸. L-Gln 主要生理功能如下: 治療胃腸潰瘍1.因外源 L-Gln 能促使膽汁分泌和 正常排糞,故 L-Gln 已用于臨床治療腹部潰瘍,節段性 回腸炎和過敏性腸炎.如日本壽制藥株式會社生產的 "麥滋林" ,為 L - G l n / 萸磺酸鈉顆粒劑,該胃藥制劑 現已進入我國市場. 緩解運動綜合癥或運動疲勞2.L-Gln可以調節蛋白 質合成,抑制

3、蛋白質降解,糖原合成,細胞生長,激 活免疫,提高生長激素水平.讓成年人喝下一瓶含有 2g L-Gln 的飲料,90min 內,其血液樣品中生長激素最 高可增長 4 3 0 % .目前已大量用于治療運動員的運動綜 合癥和高強度勞動或運動后的疲勞恢復. 調節機體免疫力3-4.外源 L-Gln 會刺激免疫球蛋白 分 泌 ,促 進 免 疫 系 統 重 建 ,如 : 燒 傷 ,艾 滋 病 ,關 節炎等免疫系統的恢復. 增強腦神經機能5 .L-Gln 可被用作中樞神經抑制 劑,在大腦中被轉化成谷氨酸,與葡萄糖一起參與腦 代謝,以平衡腦內電流脈沖,有利于人腦的清醒和情 緒穩定,是少數幾種能克服血腦屏障和參與

4、大腦化學反 應的物質之一,被稱為"大腦燃料" . L-Gln 在癌癥治療上的潛在價值6, 減少癌癥治療中 化療和放療的副作用. 1 L- 谷氨酰胺的生產方法 由于 L-Gln 重要的生理功能和臨床治療作用,如何 實現 L-Gln 的工業化生產越來越受到關注.L-Gln 的生產 方法主要有化學合成法,酶促合成法和發酵法. 1.1 化學合成法經 L-Gln 合成酶(GS)催化而成,如圖 3 所示. 與化學合成法相比,酶促合成法反應步驟相對簡 單,其中三磷酸腺苷( A T P ) 是必需的.A T P 價格昂貴, 同時酶促反應底物 NH 4 + ,副產品二磷酸腺苷(ADP)都明

5、顯抑制 L-Gln 的生成,因此該生產方法不能滿足大規模 工業化生產的需要. 1.3 發酵法 發酵法是目前最常用的 L-Gln 生產方法,具有原料來源廣泛,生產成本低,產品質量可控,產物單一等 優點,適宜于大規模工業化生產.1 9 6 1 年,T s u n o d a 等 7 首先發現除了谷氨酸以外,在谷氨酸發酵液中還 有 L-Gln;1963 年,Oshima 等8 通過改變谷氨酸微球菌 的發酵條件使谷氨酸發酵轉向 L-Gln 發酵;七十年代, Nakanishi 等9-11進一步證實了,改變發酵條件可以使谷 氨酸產生菌從谷氨酸發酵轉向 L - G l n 發酵.八十年代 后,我國在實驗室

6、小試或中試規模中進行了 L-Gln 發酵 法生產,但是 L-Gln 產量低12-13 ,至今未能進行大規模 工業化生產. 本文對發酵法生產 L-Gln 的關鍵技術環節(如菌種選 育,發酵工藝和分離純化) 的研究進展進行綜述,并詳 細闡述L-Gln生物合成代謝調控和新型過濾及其藕聯技術 在下游分離純化過程中的應用. 2 2.1 發酵法生產 L- 谷氨酰胺 菌種選育 L-Gln 生產菌種主要來自谷氨酸生產菌,如棒桿菌C H 3O H CS2 NH3 C 5 H 9 NO 4 (Glu) C 6 H 11 NO 4 C 7 H 20 N 4 O 4 S 2 H 2S O 4 NH3 HOAC C 7

7、 H 18 N 4O 3 S 2 C 5 H 10 N 2 O 3 (L-Gln) C H 3O H N H 2N H 2 Raney 鎳 C 5 H 9 NO 4 (Glu) C 6 H 11 NO 4 C 6 H 13 N 3 O 3 H 2S O 4 C6H 10 N2O 3(L-Gln) 圖 2 化學法合成 L-Gln 流程圖 Fig.2 Chemical synthetic pathway for production of L -Gln(Corynebacterium sp.)9-11, 短桿菌(Brevibacterium sp.) 7,14 ,微球菌(Micrococcus s

8、p.)8.此外,還有非谷氨 酸生產菌, 如產黃菌(Flavobacterium rigense)的一些變 15-18 異菌種 . 目前,L-Gln 生產菌種的選育主要采用傳統的隨機 誘變結合定向篩選的方法,隨機誘變包括化學誘變,物 理誘變和物理化學復合誘變等,常用的誘變劑和誘變因 素有硫酸二乙酯,亞硝基胍,- 射線,紫外線等; 定向篩選包括對氨基苯甲酸的結構類似物磺胺胍的抗性 突變篩選,L-Gln 結構類似物抗性突變篩選,高 NH 4 + 濃 度抗性突變篩選等.此外,隨著人們對 L-Gln 生產菌株 遺傳特性的研究,通過基因工程的手段改造生產菌種提 高 L-Gln 的生產能力,有可能從根本上解

9、決 L-Gln 生產能 力低的難題. Y a m a d a 等 1 6 , 1 8 以非谷氨酸生產菌產黃菌屬 (Flavobacterium rigense)FERM-P no. 3556為起始菌種, 通過紫外誘變獲得了一株青霉素抗性突變株 FERM-P no. 3628,L-Gln 生產能力由 10g/L 提高到 25g/L. 湖北工業大學吳思方等19,24采用- 射線 - 硫酸二乙 酯 - 射線進行復合誘變,磺胺胍抗性篩選得到一株高產主要有如圖 2 所示兩種化學合成法生產 L-Gln: 由化學合成法流程圖可見,兩種方法均采用濃硫酸 作為必需的催化劑,反應條件苛刻,反應步驟多,收 率低.第

10、二種方法雖有所改進,但仍很復雜,且要求 使用催化劑 Raney 鎳,對工藝條件提出了新的要求.化 學合成法使用的化學試劑在產品中會有不同程度的殘 留,L-Gln 作為一種藥或功能食品,對純度有較高的要 求,而且大量化學試劑的使用會造成環境污染,從而 限制了產品質量及使用范圍. 1.2 酶促合成法 酶促合成法生產 L-Gln 是以 NH 4 + 及谷氨酸作原料,Glu + NH4+ + ATP GS L-Gln + ADP + Pi +H2O圖 3 酶法合成 L-Gln 流程圖 Fig.3 L -Gln produced by enzyme catalysis專題論述食 科 品 學2008, V

11、ol. 29, No. 03501菌株 SH77,L-Gln 平均生產能力由 8.2g/L 提高到 55.3g/L. 孫智杰等 在谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum) ATCC 1 4 0 6 7 中 表 達增 強 攝 氧 的 透 明 顫 菌 血 紅 蛋白基因20Gln 合成需要過量銨之間的矛盾,在谷氨酸棒桿菌突變 株 NS61 中利用 GS 酶的表達特性,設計了在線氮饑餓處 理的發酵過程;在限制初始氮源濃度的條件下,菌體在 生長后期自然進入氮饑餓狀態,G S 酶表達量增加,此 后再提供充足的銨鹽,提高 L-Gln 的合成能力,結果使 L-Gln 的產量提高了 69%,達到 11.5g/L

12、,菌體內谷氨酰 胺合成酶活性提高了 2 倍以上.李春等26提出了原位氮 饑餓與銨鹽梯度補加協同調控策略,提高了谷氨酰胺的 產量,最高產量可達 2.19%,比原位氮饑餓工藝提高了 近 72%,比未經過氮饑餓處理的舊工藝提高了近 200%, 達到 19.7g/L. 2.3 生物合成代謝調控GDH Glu + H2O + NADP +(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb),以此提高細胞 的攝氧能力及能量的供給水平,結果在溶氧濃度只有 5% 的條件下,重組菌比野生菌細胞干重提高了 1.2 倍, 達到了 54.1g/L,谷氨酸的生產能力提高了 6.5 倍,達到了 9.56g

13、/L, L-Gln的生產能力提高了1.4倍, 達到了5.51g/L. U s d i n 等 2 1 從丙酮丁醇梭桿菌( C l o s t r i d i u m acetobutylicum)P262中克隆L-Gln合成酶的編碼基因, 構 建 pHZ200 重組質粒,導入 E.coli ET8051 中進行克隆表 達,并研究了 L-Gln 合成酶的表達調控,結果發現 L-Gln 合成酶不受腺嘌呤共價修飾調控,重組菌的生長速度是 野生菌的 1 . 7 倍;Y a m a m o t o 等 2 2 從腐臭假單胞菌 (Pseudomonas taetrolens)中克隆谷氨酰胺合成酶基因Y-

14、3 0 ,導入大腸桿菌中進行克隆表達,其表達量是 Pseudomonas taetrolens 中的 30 倍.上述基礎工作,為 構建工程菌大規模工業化生產 L-Gln 奠定了一定基礎. 2.2 2.2.1 發酵工藝 培養基 Nabe 等16 研究了 NH 4 + 濃度和延胡索酸對產黃菌屬 (Flavobacterium rigense)生產L-Gln的影響, 結果發現 延胡索酸是 L - G l n 生產的關鍵影響因子;高濃度 N H 4+ +2-oxoglutarate + NH4+ + NADPH + H+ Glu + NH4+ + ATP GSL-Gln + ADP + P i + H

15、2O GDH 2Glu + NADP +L-Gln + 2-oxoglutarate + NADPH + H +圖 4 L-Gln 發酵生產相關的生物反應及其關鍵酶 Fig.4 Related reaction and key enzyme for production of L-GlnL-Gln 生物合成是以谷氨酸(glutamate)和 NH4 + 為底 物, 在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的催 化下合成的.L-Gln 生物合成在細胞內是一個動態平衡 的過程,除了受到谷氨酰胺合成酶(GS)調控外,還受到 谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydro

16、genase,GDH),谷氨 酸合酶(glutamate synthase, GOGAT)的調控(圖4)27. 因 此,代謝調控生物合成 L-Gln,須建立一套協同調控策 略,促進谷氨酰胺合成酶( G S ) 活性,抑制谷氨酸合酶 (GOGAT) 活性,抑制 L - G l n 的降解,從而過量合成 L - Gln. 2.3.1 生物合成途徑中關鍵酶的調控 Tesch 等 2 8 在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中研究了 N H 4 + 濃度對 G D H,GS,G O G A T 活性的影響,結果發現 N H 4 + 濃度從 1 m m o l / L

17、增加至 90mmol/L 時,GDH 活性維持在 1.3U/mg 蛋白,沒有發 生變化,但當 NH4+ 濃度大于 10mmol/L 時,GS,GOGAT 活性小于 1mmol/L 的 10%,即分別低于 110U/mg 蛋白, 4 2 U / m g 蛋白;并且發現谷氨酸脫氫酶酶促反應是谷氨 酸棒桿菌攝取 N H 4 + 的第一步反應.此研究結果為梯度 補氮生產 L-Gln 提供了理論基礎. S c h u l z 等 2 9 考察了碳源和氮源對谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 中 GS 和 G O G A T 活性的影響,結果發現在碳

18、源充足,氮源缺乏 的條件下,G S 和 G O G A T 活性分別提高了 5 倍和 7 倍; 在碳源和氮源都缺乏的情況下 G S 活性下降了 3 倍,(0.9%1.6%)有利于 L-Gln 的生產,但是當 NH4+ 濃度大 于 1.8% 時又會抑制 L-Gln 的生產;最終得出當 NH 4 濃 度為 0.9%1.6%,延胡索酸濃度為 5.5% 時,L-Gln 生 物合成達到最大值 25g/L. A n d e r s o n 等 2 3 考察了 N a C l 對金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)生產 L-Gln 的影響,結果發現 添加 5.8% 的 NaCl ,

19、L - G l n 的含量提高了 2 8 0 0 %,達 到 161.82nmol/mg 干細胞;添加 10% NaCl,L-Gln 的含 量提高了 3400%,達到 195.71nmol/mg 干細胞. 湖北工業大學吳思方等24 研究了氮源種類和濃度, 金屬離子,CaCO 3 等對 L-Gln 生產的影響,得出最佳發 酵培養基為:葡萄糖 1 6 % ,氯化銨 4 % ,玉米漿 0 . 5 % , 磷酸氫二鉀 0.05%,磷酸二氫鉀 0.05%,硫酸鎂 0.05%, 尿素 1.4%,硫酸亞鐵 0.5mg/100ml,硫酸錳 2.5mg/100ml, 硫酸鋅 0.5mg/100ml, 1 0.1

20、mg/100ml, VB 結果使菌株SH77 的 L-Gln 生產能力平均達 53.0g/L,最高達 56.2g/L,這 是目前文獻報道的最高產量. 2.2.2 發酵控制方式 因為L-Gln生物合成是在谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)催化下進行的,所以發酵法生產 L-Gln 的關鍵在于調控 G S 酶活性微生物發酵法是 L-Gln 的主要生產方法,生產國主 要是日本,韓國也有少量生產.1 9 7 7 年日本用發酵法 生產 L-Gln 的年產量達 100t,1979 年上升到 500t,1990 年則上升到 1200t,并有逐年遞增的趨勢.全世界 L-Gln 生產量

21、逐年遞增,在 1986 年為 900t,1990 年為 1800t, 目前年產量約為10000t. 我國已有不少企業研究L-Gln發 酵生產工藝,但只是在實驗室小試或中試規模中生產 L- Gln.由于發酵法生產 L-Gln 國外僅日本等幾個國家生 產,所以國際市場對我國 L-Gln 出口需求迫切,預計年 出口量將迅速達到 1000t. 對于我們這樣一個 13 億人口的大國,L-Gln 等藥用 氨基酸需求量很大,有巨大的潛在市場,目前我國藥 用 L-Gln 依靠進口且價格昂貴.預計國內 L-Gln 需求可達 5000 噸 / 年,現在國際市場上 L-Gln 價格大約 100 萬元左 右 / 噸,L-Gln 的生產成本大約為谷氨酸的 34 倍,產 值達到