1、實驗2 柱色譜分離植物色素（一） 實驗目的 1通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質分離提純方法； 2了解柱層析的基本原理，掌握柱層析的操作技術。3通過柱色譜分離操作，加深了解微量有機物色譜分離鑒定的原理。（二）實驗原理層析法是一種物理分離方法。柱層析法是層析方法中的一個類型，分為吸附柱層析法和分配柱層析法。本實驗僅介紹吸附柱層析法。吸附柱層析法是分離、純化和鑒定有機物的重要方法。它是根據混合物中各組分的分子結構和性質（極性）來選擇合適的吸附劑和洗脫劑，從而利用吸附劑對各組分吸附能力的不同及各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達到分離目的。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入表面積很大、經過活化

2、的多孔性或粉狀固體吸附劑（常用的吸附劑 有氧化鋁、硅膠等）。當混合物溶液流過吸附柱時，各組分同時被吸附在柱的上端，然后從柱頂不斷加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物吸附能力不同，從而隨著溶劑下移的速度不同，于是混合物中各組分按吸附劑對它們所吸附的強弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶，如圖所示。 9-1 色層的展開在洗脫過程中，柱中連續不斷地發生吸附和溶解的交替現象。被吸附的組分被溶解吸出來，隨著溶劑向下移動，又遇到新的吸附劑顆粒，把組分從溶液中吸附出來，而繼續流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動，這樣經過適當時間移動后，各種組分就可以完全分開，繼續用溶劑洗脫，吸附能力最弱的組分隨溶劑首先流出，

3、再繼續加溶劑直至各組分依次全部由柱中洗出為止，分別收集各組分。綠色植物如菠菜葉中含有葉綠素（綠）、胡蘿卜素（橙）和葉黃素（黃）等多種天然色素。葉綠素存在兩種結構相似的形式即葉綠素 a和葉綠素 b，其差別僅是 a 中一個甲基被 b 中的甲酰基所取代。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡合物，是植物進行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素 a 的含量通常是b的3倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團，但大的烴基結構使它易溶于醚、石油醚等一些非極性的溶劑。 胡蘿卜素是具有長鏈結構的共軛多烯。它有三種異構體，即 a-,-和-胡蘿卜素，其中-異構體含量最多，也最重要。在生物體內，-體受酶催化氧化即形成維生素A

4、。目前-胡蘿卜素已可進行工業生產，可作為維生素 A 使用，也可作為食品工業中的色素。 葉黃素是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。與胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小。本實驗是用活性氧化鋁作吸附劑，分離菠菜中的胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。(三） 主要試劑與儀器 研缽、布氏漏斗、圓底燒瓶、直形冷凝管、層析柱，抽濾瓶，燒杯，鐵架臺，脫脂棉，海沙，中性氧化鋁，乙醇，石油醚（6090），丙酮，菠菜葉（四） 操作步驟 1. 菠菜色素的提取 稱取5g 洗凈后的新鮮的菠菜葉，用剪刀剪碎后放入研缽，稍加研磨后加入約15mL 3:2（體積比）的石油醚/乙醇混合

5、液，繼續研磨約5min，然后用布氏漏斗抽濾菠菜汁，棄去濾渣。（可以用相同的方法再提取一次，合并濾液）將濾液轉入分液漏斗，加入30mL水萃取洗滌（分兩次，每次15mL），以徹底除去萃取液中的乙醇。洗滌時要輕輕旋蕩，防止產生乳化。處于上層的石油醚層用無水硫酸鈉干燥后濾入圓底燒瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至體積約為2mL為止。2裝柱 取一支潔凈干燥的層析柱玻管，自柱口塞入少許脫脂棉并用長玻棒推至柱底壓平（塞時不宜太緊）。從柱口小心裝入活性氧化鋁（160200目，于300- 400 活化34小時），邊裝邊輕輕敲打層析柱，使填裝緊密均勻，直至氧化鋁粉柱高達8厘米時為止。然后在柱頂再加上一層0.5cm高的

6、海沙。將此層析柱固定在鐵架臺上，下面接一個干凈的抽濾瓶，裝置如圖所示。3加樣 打開層析柱下端活塞，將抽濾瓶與水泵相連，抽氣減壓。用小燒杯從柱口沿管壁小心加入石油醚流出（切勿把氧化鋁表面沖亂）。當柱頂尚留有12ml石油醚時，停止減壓（使用前抽濾瓶應該干燥，這樣回收的石油醚倒出后，可以用于配制洗脫液），加入混合溶液2ml（預先準備好的濃縮液）。待色素全部進入柱體后，在柱頂小心加洗脫劑石油醚/丙酮溶液 9:1 （體積比）。打開活塞，讓洗脫劑逐滴放出，層析即開始進行，用錐形瓶收集。當第一個有色成分即將滴出時，取另一錐形瓶收集，得橙黃色溶液，它就是胡蘿卜素。 用石油醚-丙酮 7:3 （體積比）作洗脫劑，

7、分出第二個黃色帶，它是葉黃素。再用丁醇/乙醇/水 3:1:1 （體積比）（或者用石油醚丙酮（1:1）溶液）洗脫葉綠素 a （藍綠色）和葉綠素 b （黃綠色）。收集各色帶后，轉入棕色瓶低溫保存。五注意事項1層析柱裝填緊密與否, 對分離效果影響很大。若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能有斷層）時，會影響滲透速度和顯色的均勻。2在吸附柱上端加入海沙是為了加樣品和洗脫劑時不致把吸附劑沖起，影響分離效果；在吸附柱下端加入脫脂棉是為了防止吸附劑細粒流出。3為了保持吸附柱的均一性，應該使整個吸附劑浸泡在溶劑或溶液中，即從第一次注入乙醇起直至實驗完畢，絕不能讓柱內液體之液面降至沙層之下。否則當柱中溶劑或溶液流干時，會使柱身干裂。若再重新加入溶劑，會使吸附柱的各部