1、微波輻射對PC12細(xì)胞突觸素I表達(dá)的影響及其機制【摘要】 目的: 探討微波輻射對PC12細(xì)胞突觸素I表達(dá)及其磷酸化水平的影響, 并通過對其相關(guān)影響因子BDNF及其受體TrkB改變的探討, 初步揭示突觸素I改變的機制。方法: 采用30 mW/cm2微波輻射PC12細(xì)胞, 于輻射后1 h, 通過HPLC檢測氨基酸遞質(zhì)釋放的改變; 于輻射后3 h、 9 h、 1 d和2 d, 通過RTPCR、 Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測突觸素I, BDNF和TrkB表達(dá)以及突觸素I磷酸化的改變; 通過免疫共沉淀檢測BDNF和TrkB相互作用的改變。結(jié)果: 30mW/cm2微波輻射后1h, PC12細(xì)

2、胞釋放的Asp、 Glu、 GABA和Gly均減少（P<0.01）; 突觸素mRNA于輻射后39 h減少, 1 d增加（P<0.01或P<0.05）, 2 d基本恢復(fù); 其蛋白于輻射后9 h2 d減少（P<0.01或P<0.05）; 磷酸化的突觸素在輻射后39 h減少, 1 d增加, 2 d又見減少（P<0.01或P<0.05）。BDNF mRNA于輻射后39 h減少, 1 d增加, 2 d又見減少（P<0.01或P<0.05）; 其蛋白于輻射后3 h減少, 12 d又

3、見增加（P<0.05或P<0.01）。TrkB mRNA在輻射后3 h和2 d減少; 其蛋白于輻射后3 h1 d增加（P<0.05或P<0.01）, 2 d基本恢復(fù)。BDNF和TrkB的相互作用于輻射后39 h增強, 12 d減弱（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論: 微波輻射可引起PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放障礙, 突觸素表達(dá)及其磷酸化水平降低, BDNF和受體TrkB表達(dá)及其相互作用異常, 參與微波輻射所引起的PC12細(xì)胞信息傳遞障礙及其修復(fù)過程。 【關(guān)鍵詞】 微波 PC12細(xì)胞 突觸素I BDNF TrkB

4、突觸傳遞在突觸可塑性中發(fā)揮重要作用, 大多神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)活性物質(zhì)儲存在突觸囊泡中, 通過胞吐作用釋放出來。囊泡錨定過程是突觸胞吐的始發(fā)階段, 這個過程需要磷酸化依賴的突觸素參與。腦源性神經(jīng)生長因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)可通過作用于其受體TrkB激活Ras/MAPK信號通路, 影響突觸素的表達(dá)和磷酸化1。由于原代神經(jīng)元的培養(yǎng)條件要求較高, 且細(xì)胞數(shù)量有限, 在基因水平干預(yù)較難操作, 故在實驗研究中受到很大的限制。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系, 在神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)誘導(dǎo)后作為較成熟的

5、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)模型, 已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞分化、 離子通道、 受體、 遞質(zhì)釋放、 神經(jīng)毒性等的研究2。因此本實驗中以PC12細(xì)胞為模型, 對微波輻射后氨基酸遞質(zhì)釋放、 突觸素及其磷酸化水平、 BDNF及其受體TrkB的改變進(jìn)行探討, 為闡明微波輻射致突觸傳遞改變的機制奠定實驗基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料 PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫, 由本室傳代保存; DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司; 胎牛血清購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所; Asp、 Glu、 GABA和Gly購自美國Sigma公司; NGF、 兔抗突觸素IgG和兔抗磷酸化的突觸素IgG均購自美國Che

6、micon公司; 兔抗TrkB IgG購自武漢博士德生物工程有限公司; 兔抗BDNF IgG、 生物素化羊抗兔IgG、 HRP鏈親和素和DAB均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; 蛋白A瓊脂糖購自美國Santa crutz公司; 用于BDNF、 TrkB、 突觸素I和actin PCR擴增的成對引物序列由北京奧科公司合成。1.2 方法1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇PC12細(xì)胞, 傳3代后, 采用0.05 mg/L NGF, 10 mL/L胎牛血清的DMEM誘導(dǎo)其分化, 714 d后可見其有明顯突起長出, 用于下一步實驗。1.2.2 輻射方法 PC12細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中, 置于布滿

7、吸收材料的微波室內(nèi), 放在輻射臺上接受輻射, 平均功率密度為30 mW/cm2, 輻射時間為5 min。假輻射組僅放置于輻射臺上5 min, 不給予輻射。1.2.3 高效液相色譜儀檢測PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放 輻射后1 h, 收集細(xì)胞, 1000 r/mim離心10 min, 取上清; 加入100 g/L磺基水楊酸, 5000 r/min離心15 min; 取上清, 加入2 mol/L KHCO3, 5000 r/min離心15 min; 取上清, 4保存。用高效液相色譜儀檢測神經(jīng)遞質(zhì), 100 L衍生試劑內(nèi)加入20 L 樣品, 振蕩2 min, 進(jìn)樣針加樣20 L。數(shù)據(jù)處理: 測得的數(shù)據(jù)為

8、被測氨基酸所占的峰面積（A樣）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（A標(biāo)）和濃度（C標(biāo)）比, 可計算出被測氨基酸的濃度（C樣）: C樣(mg/L)=C標(biāo)×A樣/A標(biāo)。1.2.4 RTPCR法檢測 PC12細(xì)胞BDNF、 TrkB和突觸素I mRNA BDNF: 上游引物為TTACCTGGATGCCGCAAACA, 下游引物為GGCCCGAACATACGATTGG; TrkB: 上游引物為TGGGACGTTGGGAATTTGGTT, 下游引物為CAGCCGTGGTACTCCGTGTG; 突觸素: 上游引物為CTGCTGGTCCCATTCGTCAG, 下游引物為GCTGGCGAAAGACTTCCTCAG;

9、 actin: 上游引物為CTGTGCCCATCTATGAGGGTTAC, 下游引物為AATCCACACAGAGTACTTGCGCT。于輻射后3 h、 6 h、 9 h、 1 d 和2 d收集細(xì)胞, 參照TRIzol試劑說明書方法提取總RNA, 其A260/280在1.72.0之間。各組各時間點RNA提取物每1.5 g中加入OligoP(dT)18 Primer 0.5 L, 無RNA酶的水補充至6 L, 70 5 min; 再加入5×反應(yīng)液2 L, RNA酶抑制劑0.5 L和dNTP 混合物1 L, 37水浴5 min后加入0.5 L AMVRT, 42 60 min; 之后70反

10、應(yīng)10 min, 4或冷凍保存。以actin為內(nèi)參照進(jìn)行PCR, 突觸素I cDNA擴增條件為94 3 min, 94 30 s, 57 45s（BDNF 55 45 s; TrkB 56 30 s; actin 54 30 s）, 72 45 s, 72 5 min; 均為25個循環(huán)。取5 L PCR產(chǎn)物與1 L DNA上樣緩沖液混勻后在10 g/L的凝膠上電泳, 用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot方法檢測PC12細(xì)胞BDNF、 TrkB、 突觸素以及磷酸化的突觸素 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測: 輻射后3 h、 9 h、 1 d和2 d制作細(xì)胞爬片, 甲醇/丙酮

11、 (11) 固定10 min, 4保存; 細(xì)胞爬片復(fù)溫; 0.1 mol/L PBS洗滌3×3 min; 30 mL/L H2O2室溫孵育10 min; 0.1 mol/L PBS洗滌3×3 min; 1 g/L胰酶抗原修復(fù)5 min; 0.1 mol/L PBS洗滌3×3 min; 血清封閉10 min; 加適當(dāng)比例稀釋的一抗, 37 1 h, 4過夜; 0.1 mol/L PBS洗滌3×3 min; 加生物素化的羊抗兔IgG（1200）, 37 50 min; 0.1 mol/L PBS洗滌3×3 min; 加HRP鏈親和素（1200）,

12、37 50 min; 0.1 mol/L PBS洗滌3×3 min; DAB顯色, 鏡下控制顯色效果, 充分水洗、 脫水、 透明和封片。選用PBS作為一、 二和三抗的陰性對照。在光鏡10×40倍視野下, 應(yīng)用CMIAS圖像分析儀對BDNF和TrkB的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果進(jìn)行積分光密度（integral optical density, IOD）和平均光密度（mean optical density, MOD）測定。Western blot檢測, 于輻射后3 h、 9 h、 1 d和2 d, 制備PC12細(xì)胞總蛋白后, 測定蛋白濃度, 上樣, 電泳, 轉(zhuǎn)膜, 用PBST清洗PVD

13、F膜, 100 g/L脫脂奶粉常溫封閉3 h; 加兔抗突觸素I多抗或兔抗磷酸化的突觸素I多抗（含100 g/L脫脂奶粉的PBST稀釋11000）, 4過夜, PBST清洗 3×10 min; 加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG (PBST液12000 稀釋), 常溫1 h, PBST清洗3×10 min; 采用發(fā)光底物試劑盒顯影。將目的條帶掃描后應(yīng)用CMIAS圖像分析儀, 測目的條帶的IOD值, 將掃描值與actin掃描值相比, 然后以樣本/內(nèi)參照的比值表示突觸素I/磷酸化的突觸素I的表達(dá)水平。1.2.6 免疫共沉淀方法檢測PC12細(xì)胞BDNF和TrkB相互作用 于輻射后3 h、

14、 9 h、 1 d和2 d, 取300 g PC12細(xì)胞蛋白加裂解液補足至250 mL; 加5 mL兔抗BDNF多抗, 搖床4震搖1 h; 加20 L蛋白A瓊脂糖, 4搖過夜; 2500 r/min離心5 min; 棄上清, 收取瓊脂糖沉淀; 加入冰浴裂解液洗4次, 離心取沉淀; 加入20 L裂解液及20 L上樣緩沖液; 100水浴3 min, 4000 r/min離心10 min, 使瓊脂糖沉淀, 取上清; 進(jìn)行Western blot分析, 一抗加兔抗TrkB多抗(含100 g/L 脫脂奶粉的PBST稀釋11000)。顯影后, 將目的條帶掃描后應(yīng)用CMIAS圖像分析儀, 測目的條帶的IOD

15、值。1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 文中數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示, 采用SAS軟件進(jìn)行單因素方差分析, P<0.05者具有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放的改變 30 mW/cm2輻射后1 h PC12細(xì)胞釋放的Asp、 Glu、 GABA和Gly均減少（表1）。表明30 mW/cm2輻射后PC12細(xì)胞間信息傳遞受抑制。表1 微波輻射后1 h PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放的改變（略）Tab 1 Change of the release of amino acids in PC12 cells at 1 h after microwave radia

16、tion（略）bP<0.01 vs control group.2.2 PC12細(xì)胞突觸素和磷酸化的突觸素表達(dá)的改變 (1)突觸素mRNA的改變: 30 mW/cm2輻射后39 h見突觸素mRNA減少, 1 d增加, 2 d基本恢復(fù)（圖1）, 提示微波輻射后PC12細(xì)胞突觸素轉(zhuǎn)錄存在異常。(2)突觸素和磷酸化的突觸素表達(dá)的改變: 30 mW/cm2輻射后9 h2 d突觸素表達(dá)減少, 但有恢復(fù)趨勢; 磷酸化的突觸素表達(dá)在輻射后39 h減少, 1 d增加, 2 d又見減少（圖2和表2）; 提示微波輻射后PC12細(xì)胞的囊泡錨定存在障礙。圖1 微波輻射后PC12細(xì)胞突觸素mRNA的變化（

17、略）Fig 1 Change of synapsin I mRNA in PC12 cells after microwave radiationaP<0.05, bP<0.01 vs control group.圖2 微波輻射后PC12細(xì)胞突觸素和磷酸化突觸素表達(dá)的變化（略）Fig 2 Change of synapsin I and its phosphorylation expression in PC12 cells after microwave radiationA, B: Expression of synapsin I and its phospho

18、rylationrespectively; C: Expression of actin. 1: Control; 2-5: 3 h, 9 h, 1 d and 2 d after 30 mW/cm2 radiation, respectively.表2 微波輻射后PC12細(xì)胞突觸素和磷酸化突觸素表達(dá)改變的定量分析結(jié)果（略）Tab 2 Quantitative analysis of synapsin I and its phosphorylation expression in PC12 cells after microwave radiationaP<0.05, bP&am

19、p;lt;0.01 vs control group.2.3 PC12細(xì)胞BDNF的改變 (1) BDNF mRNA: 30 mW/cm2輻射后39 h BDNF mRNA減少, 1 d增加, 2 d又見減少（圖3）, 表明微波輻射后PC12細(xì)胞BDNF轉(zhuǎn)錄減少。(2) BDNF蛋白: 陰性對照結(jié)果為陰性。假輻射組PC12細(xì)胞質(zhì)BDNF呈棕黃色陽性表達(dá)(圖4A)。30 mW/cm2輻射后3 h, PC12細(xì)胞質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)減少; 9 h后增加(圖4B), 2 d基本恢復(fù)。其定量分析結(jié)果同上(表3)。圖3 微波輻射后PC12細(xì)胞BDNF mRNA的變化（略）Fig 3 Change of BD

20、NF mRNA in PC12 cells after microwave radiationbP<0.01 vs control group.表3 微波輻射后PC12細(xì)胞BDNF表達(dá)的定量分析結(jié)果（略）Tab 3 Quantitative analysis of BDNF expression in PC12 cells after microwave radiationbP<0.01 vs control group.2.4 PC12細(xì)胞TrkB的改變 (1)TrkB mRNA: 30 mW/cm2輻射后39 h TrkB mRNA減少, 1 d恢復(fù), 2 d又

21、見減少（圖5）, 表明微波輻射后PC12細(xì)胞TrkB轉(zhuǎn)錄減少。(2) TrkB蛋白: 陰性對照結(jié)果為陰性, 假輻射組PC12細(xì)胞質(zhì)TrkB呈棕黃色(圖6A)。30 mW/cm2輻射后9 h TrkB表達(dá)有所增加(圖6B), 2 d仍未恢復(fù)。其定量分析結(jié)果同上(表4)。圖4 PC12細(xì)胞中BDNF的表達(dá)（略）Fig 4 The expression of BDNF in PC12 cells (LSAB, ×420)A: Control, BDNF was positive in the cytoplasm of PC12 cells; B: BDNF was increased at

22、 the ninth hour after microwave radiation.圖5 微波輻射后PC12細(xì)胞TrkB mRNA的改變（略）Fig 5 Change of TrkB mRNA in PC12 cells after microwave radiationbP<0.01 vs control group.圖6 PC12細(xì)胞中TrkB的表達(dá)（略）Fig 6 The expression of TrkB in PC12 cells (LSAB, ×420)A: Control, TrkB was positive in the cytoplasm of PC

23、12 cells; B: TrkB was increased at the ninth hour after microwave radiation.表4 微波輻射后PC12細(xì)胞TrkB表達(dá)的定量分析結(jié)果（略）Tab 4 Quantitative analysis of TrkB expression in PC12 cellsafter microwave radiationbP<0.01 vs control group.2.5 BDNF和TrkB相互作用的改變 30 mW/cm2輻射后39 h BDNF和TrkB相互作用增強, 但1 d后減弱, 2 d仍未恢復(fù)（圖7）。表

24、明微波輻射PC12細(xì)胞后, BDNF與其受體TrkB結(jié)合量減少, 可能進(jìn)一步影響微波輻射后腦損傷的恢復(fù)過程。圖7 微波輻射后PC12細(xì)胞BDNF和TrkB相互作用的改變（略）Fig 7 Change of interaction between BDNF and TrkB in PC12 cells after microwave radiation1: Control; 2-5: 3 h, 9 h, 1 d and 2 d after 30 mW/cm2 radiation, respectively. aP<0.05, bP<0.01 vs control gr

25、oup.3 討論 突觸前結(jié)構(gòu)中, 大多神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)活性物質(zhì)儲存在突觸囊泡中, 通過胞吐作用釋放出來。在胞吐過程中, 突觸囊泡錨定在突觸前末端的活性區(qū), 需要磷酸化依賴的突觸素的參與, 且錨定過程是突觸胞吐發(fā)揮作用的始發(fā)階段, 該過程能否啟動, 直接影響到囊泡胞吐全過程的繼續(xù)。由于體內(nèi)環(huán)境影響因素較多, 為了深入探討突觸素在微波輻射致突觸傳遞改變中的作用, 我們選用NGF誘導(dǎo)后的PC12細(xì)胞為體外模型。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系, 在NGF作用下分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞: 細(xì)胞停止增殖; 形成神經(jīng)突起和突觸樣連接; 出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞特有的細(xì)胞膜電位2, 3。微波輻射對PC12細(xì)胞的影響報道

26、少見, 楊學(xué)森等4, 5采用未經(jīng)NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)現(xiàn), 65 mW/cm2電磁波輻射20 min可引起PC12細(xì)胞損傷（細(xì)胞存活率明顯降低, 乳酸脫氫酶釋放率增加, 細(xì)胞凋亡率增加）, 激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng), 其中ERK1/2、 JNK、 P38MAPK表現(xiàn)為差別激活。 本研究中, 30 mW/cm2輻射后6 h, PC12細(xì)胞釋放的四種氨基酸遞質(zhì)減少, 提示囊泡胞吐存在障礙或遞質(zhì)合成減少。為了揭示遞質(zhì)釋放障礙的原因, 本研究以突觸素為靶點, 對其表達(dá)和磷酸化的改變以及相關(guān)影響因素BDNF進(jìn)行了深入探討。突觸素一方面通過對突觸結(jié)構(gòu)的影響6, 另一方面通過其磷酸化作用調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放

27、7, 8, 從而在突觸可塑性中起一定作用。微波輻射后突觸素表達(dá)和磷酸化的改變未見報道。本實驗顯示30 mW/cm2微波輻射后突觸素mRNA、 蛋白及磷酸化水平均減少, 且蛋白改變晚于基因改變。磷酸化的突觸素改變早于突觸素, 因為突觸素主要以磷酸化的形式發(fā)揮作用, 故磷酸化的突觸素在輻射早期即見減少, 可能正是遞質(zhì)釋放障礙的原因之一。BDNF作用于其受體TrkB激活Ras/MAPK信號通路, 影響突觸素的磷酸化及其表達(dá)1, 9, 進(jìn)一步影響Glu和GABA的釋放; 也可增加CREB和突觸素的mRNA水平10, 11。本研究發(fā)現(xiàn), 30 mW/cm2微波輻射后BDNF mRNA呈減少增加減少的改變

28、; 蛋白先減少后增加。由于mRNA改變一般早于蛋白改變, 故蛋白12 d增加與mRNA改變基本一致; 但2 d時mRNA減少, 可能引起2 d后蛋白進(jìn)一步的減少。微波輻射后TrkB mRNA減少, 蛋白增加, 可見蛋白和mRNA改變并不一致; 但為何mRNA的減少未引起蛋白的減少, 原因并不明確, 可能與BDNF減少后, TrkB反應(yīng)性的升高, 隨之其合成受限有關(guān)。BDNF和TrkB的相互作用在微波輻射后先增強后減弱, 相互作用增強是細(xì)胞的一種保護(hù)性反應(yīng), 對細(xì)胞損傷進(jìn)行恢復(fù)性調(diào)節(jié); 但之后減弱, 表明細(xì)胞存在損傷, 可能在二者表達(dá)都增加（2 d）后, 相互作用也會有所恢復(fù)。BDNF和TrkB

29、相互作用減弱可能引發(fā)突觸素表達(dá)和磷酸化的減弱, 1 d時突觸素mRNA及其磷酸化水平的波動性變化可能與BDNF的保護(hù)性作用有關(guān)。BDNF可能與減慢微波輻射后PC12細(xì)胞的損傷并促進(jìn)其修復(fù)有關(guān)。 總之, 微波輻射可引起PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放障礙, 突觸素表達(dá)及其磷酸化水平降低, BDNF和受體TrkB表達(dá)及其相互作用異常, 參與了微波輻射所引起的PC12細(xì)胞信息傳遞障礙及其修復(fù)過程。【參考文獻(xiàn)】 1 張廣獻(xiàn), 祝其鋒. NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的研究J. 生物學(xué)雜志, 2002, 19(4): 129-130.2 Griesbach GS, Hovda DA, Molteni R, et

30、al. Alterations in BDNF and synapsin I within the occipital cortex and hippocampus after mild traumatic brain injury in the developing rat: reflections of injuryinduced neuroplasticityJ. J Neurotrauma, 2002, 19(7): 803-814.3 Nam CI, Chen L. Postsynaptic assembly induced by neurexinneuroligin interaction and neurotransmitterJ. PNAS, 2005, 102(17): 137-6142.4 楊學(xué)森, 龔茜芬, 張廣斌, 等. 電磁輻射急性輻照致PC12細(xì)胞的損傷效應(yīng)J. 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 6(2): 81-84.5 楊學(xué)森, 龔茜芬, 張廣斌, 等.電磁輻射誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中絲裂原活化蛋白激酶的差別激活J. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2005, 23(3): 167-171.6 Kwon KB, Kim JS, Chang BJ. Translocational changes of local