1、CpG-containing 寡聚脫氧核苷酸對(duì)新化療藥物Coramsine的抗腫瘤增強(qiáng)效應(yīng)概述Coramsine（即龍葵總堿）是一種從Solanum linnaeanum（devils apple）中提取出來的新的化療藥物臨床上主要用于治療皮膚腫瘤本實(shí)驗(yàn)通過研究Coramsine對(duì)惡性間皮細(xì)胞瘤的小鼠模型的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)來探討Coramsine更廣泛的臨床應(yīng)用前景研究發(fā)現(xiàn)Coramsine全身用藥可以延緩腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)小鼠生存期并且當(dāng)Coramsine與ODNs 聯(lián)用時(shí),未甲基化的ODNs作為先天免疫系統(tǒng)的激活物可以增強(qiáng)Coramsine的抗腫瘤效應(yīng).兩藥聯(lián)用更為有效的延緩了腫瘤的生長(zhǎng)和提供生

2、存獲益. Coramsine 可能是通過直接裂解細(xì)胞的方式來殺死腫瘤細(xì)胞.我們用兩種不同的方法來檢測(cè)凋亡(caspase 激活和DNA斷裂),沒有發(fā)現(xiàn)Coramsine誘導(dǎo)任何形式的程序化細(xì)胞死亡的證據(jù).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 由ODNs 增強(qiáng)的Coramsine的抗腫瘤效應(yīng)表明Coramsine介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種與免疫學(xué)無關(guān)的事件。關(guān)鍵詞化學(xué)治療, CpG寡聚脫氧核苷酸,免疫治療, 惡性間皮細(xì)胞瘤(J Immunother 2006;29:134-142) 細(xì)胞毒性化療仍然是大部分實(shí)體腫瘤治療的最好選擇.然而,并非所有腫瘤都對(duì)此有效.單一模式的藥物化療已經(jīng)很難治愈腫瘤,部分原因是目前的單藥治療容易導(dǎo)致

3、腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性.因此有必要探索新的化療藥物用于以后的化療或與其他治療方式的聯(lián)用上.一般情況下我們通過以下兩種思路尋找藥物。一是新藥物能夠特異性的干擾象細(xì)胞繁殖這樣的生化途徑，如抗代謝藥物吉西他濱.二是,新藥物中的有效成分可以在天然復(fù)合物中被發(fā)現(xiàn)和提取出來，如紅豆杉、紫杉酚類的藥物。 Daunter 和 Cham在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)在澳大利亞昆士蘭地區(qū)的一種叫做Solanum linnaeanum （即龍葵）的植物可以有效的延緩牲畜皮膚癌的發(fā)展在此基礎(chǔ)上提出了幾種具有細(xì)胞毒作用的甾體生物堿苷類成分。混合物中的兩種活性生物堿成分澳洲茄堿和澳洲茄邊堿共享一個(gè)各種三糖碳水化合物附著的甾體配基。隨

4、后人們把這兩種復(fù)合物用來治療表淺的皮膚疾病如角化病、基底細(xì)胞癌、和鱗狀細(xì)胞癌，并把它推向市場(chǎng)。澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的混合物最初被稱為SBP002現(xiàn)在被命名為Coramsine，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它有更寬的抗癌譜說明其可能有更廣的應(yīng)用范圍。最初人們提出龍葵總堿的細(xì)胞毒作用是直接裂解細(xì)胞。現(xiàn)在也有觀點(diǎn)認(rèn)為誘導(dǎo)凋亡也是這些生物堿類的細(xì)胞毒作用機(jī)制。但在我們實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，尚未發(fā)現(xiàn)支持龍葵總堿誘導(dǎo)凋亡的證據(jù)。我們?cè)趷盒蚤g皮細(xì)胞瘤的小鼠模型上進(jìn)一步研究了Coramsine對(duì)實(shí)體腫瘤的療效。實(shí)驗(yàn)證明Coramsine全身用藥可以減緩腫瘤生長(zhǎng)和提供適度的生存獲益。Coramsine 目前正在由Australia S

5、pecial Access Scheme機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估。這是一個(gè)對(duì)未上市藥品有選擇性的對(duì)病人進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的機(jī)構(gòu)。近年來，腫瘤化療逐漸與免疫治療相結(jié)合。我們先前的實(shí)驗(yàn)證明抗代謝藥物吉西他濱作用于惡性間皮細(xì)胞瘤小鼠模型，可以通過凋亡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡并增加了淋巴灌注區(qū)（DLNs）腫瘤抗原的表達(dá)。吉西他濱聯(lián)合對(duì)抗抗-CD40的FGK-45抗體激活樹狀突細(xì)胞上的CD-40的免疫輔助的治療方式對(duì)腫瘤有很高的治愈率。目前化療和免疫結(jié)合的綜合治療已經(jīng)越來越多樣化。比較有前景的免疫治療方法是通過免疫治療來激活機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)。這種治療方式本質(zhì)上與CD-40的激活是不同的，后者實(shí)際上是一種后天獲得性免疫治

6、療。(postlicensing therapy)，如淋巴灌注區(qū)啟動(dòng)事件后的T淋巴細(xì)胞的激活。而先天免疫系統(tǒng)的激活會(huì)反過來增強(qiáng)啟動(dòng)事件 。先天免疫系統(tǒng)可以被脂多糖（LPS）、鞭毛素、雙鏈RNA、和未甲基化的含有CpG 結(jié)構(gòu)的寡聚脫氧核苷酸等不同的微生物結(jié)構(gòu)所激活，機(jī)制主要與病原體的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。細(xì)胞上的受體如TLRs識(shí)別這些結(jié)構(gòu)并激活先天免疫反應(yīng)。在臨床前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)幾種TLR配體尤其是雙鏈RNA以及與之具有相似藥代動(dòng)力學(xué)的多聚次黃嘌呤核苷酸和含有CpG 結(jié)構(gòu)的寡聚脫氧核苷酸具有抗腫瘤活性并且在與其他治療方式聯(lián)用時(shí)具有協(xié)同作用我們發(fā)現(xiàn)Coramsine對(duì)免疫系統(tǒng)有輕微毒性，因此我們研究了

7、其與不同的免疫刺激治療（如激活CD40或多聚次黃嘌呤核苷酸和含有CpG 結(jié)構(gòu)的寡聚脫氧核苷酸等TLR配體治療）相結(jié)合時(shí)的治療獲益 。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Coramsine與CpG-ODNs聯(lián)用可以降低腫瘤生長(zhǎng)速度而與FGK-45聯(lián)用時(shí)沒有協(xié)同作用。材料和方法：1 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑鼠AB1-HA惡性間皮細(xì)胞瘤細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)在DMEM中，DMEM由20mM羥乙基哌嗪乙磺酸，0.05mM 2-巰基乙醇，100u/mL 青霉素(CSL，Melbourne,Australia），50ug/mL 慶大霉素，(David Bull Labs,Warwick,UK)，和5%的胎牛血清配制而成。AB1-HA惡性間皮細(xì)胞來源于

8、AB1惡性間皮細(xì)胞。AB1細(xì)胞是由經(jīng)石棉誘導(dǎo)的惡性間皮細(xì)胞瘤的BALB/C小鼠身上得到的。AB1-HA細(xì)胞正常條件下可以逃避免疫監(jiān)視。AB1和AB1-HA屬于高度同源基因。SBP002(Coramsine)由Solbec Pharmaceuticals公司提供（Perth,Western Australia）。消毒蒸餾水稀釋Coramsine至200ug/ml，用3%冰醋酸過濾法消毒。進(jìn)一步稀釋時(shí)均用消毒的一次性蒸餾水。吉西他濱(美國(guó)印第安納波利斯禮來公司生產(chǎn)）由Sir Charles Gairdner醫(yī)院藥房提供。將吉西他濱用消毒蒸餾水稀釋成1ug/ml的原液備用，使用時(shí)用消毒蒸餾水稀釋。其

9、他材料均購于Sigma公司（Castle Hill,New South Wales,Australia）。2實(shí)驗(yàn)鼠，腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)和化學(xué)治療BALB/C(H-2d)小鼠由澳洲西部的佩思動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，養(yǎng)殖于標(biāo)準(zhǔn)條件下。AB1-HA細(xì)胞1*106個(gè)皮下接種于實(shí)驗(yàn)鼠的一側(cè)下腹部。大約10-12天后當(dāng)腫瘤直徑可捫及約1-2mm 大小時(shí)開始用藥（day0）。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹膜內(nèi)注射含有不同劑量Coramsine 的溶液200 uL。用生理鹽水稀釋的乙酸相應(yīng)的處理對(duì)照組。Coramsine用藥期間用雙腳規(guī)每周3次測(cè)量腫瘤大小。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到100mm2時(shí)，處死小鼠。3免疫治療和TLR配體治療活化的抗CD-

10、40 FGK45抗體實(shí)驗(yàn)組小鼠6天內(nèi)分3次靜脈注射（day4,6,和day9）含有FGK45 100ug（由Antonius Rolink博士贈(zèng)送）的PBS100uL。在TLR配體治療中，當(dāng)腫瘤可捫及時(shí)（day0），分別瘤內(nèi)注射含有10ug的poly I/C（Invivogen,CA），洛索立賓 (Invivogen),CpG1668(5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3),或非GpG操縱的GpG1720（5-TCCATGAGCTTCCTGATGCT-3）（德國(guó)柏林，TIB-MOLBIOL）生理鹽水50uL。每隔3天重復(fù)一次，用藥至day15。4淋巴細(xì)胞及其亞群的細(xì)胞數(shù)目分析當(dāng)腫瘤

11、可捫及時(shí)（day0），Coramsine處理AB1-HA細(xì)胞荷瘤小鼠（14mg/kg）。生理鹽水稀釋的乙酸相應(yīng)的處理對(duì)照組小鼠（14mg/kg）。在day0，1，2，7，8，9，14，15時(shí)向荷瘤小鼠體內(nèi)腹膜內(nèi)注射含有Coramsine的溶液300uL，并在day3，10，17時(shí)分批處死小鼠。分別收集小鼠脾臟、腫瘤灌注區(qū)淋巴結(jié)和對(duì)側(cè)淋巴結(jié)，制成細(xì)胞懸液，并用抗CD3和抗B-220單克隆抗體熒光標(biāo)記細(xì)胞。將細(xì)胞置于FACScalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)和CellQuest and FlowJo軟件分析結(jié)果。通過上述淋巴器官細(xì)胞懸液序列稀釋，苔盤蘭染色（Sigma）和血細(xì)胞儀記數(shù)器計(jì)算出細(xì)胞總數(shù)。5

12、 熒光激活細(xì)胞分類器和終端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端標(biāo)記脫氧尿苷三磷酸鹽（TUNEL）分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死. ApoStat異硫氰酸熒光素(R&D, 美國(guó)明尼蘇達(dá)州)檢測(cè)Caspase途徑誘導(dǎo)的凋亡.六孔板接種AB1-HA細(xì)胞，每孔2*105個(gè)，置于標(biāo)準(zhǔn)條件下（37，5%CO2）培養(yǎng)過夜。吉西他濱或Coramsine 稀釋液加入六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。收集細(xì)胞前，六孔板中每孔添加10uL，50ug/mL的ApoStat繼續(xù)培養(yǎng)半小時(shí)。然后收集細(xì)胞，PBS洗滌，用400uLPBS 重懸細(xì)胞。滴加5uL PI（propidium iodine）至細(xì)胞懸液，擱置20分鐘后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。通過終端脫氧

13、核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端標(biāo)記脫氧尿苷三磷酸鹽方法（TUNEL）檢測(cè)Coramsine用藥后的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。六孔板接種AB1-HA細(xì)胞，每孔1*106個(gè)，Coramsine致死劑量組和亞致死劑量組作用不同時(shí)段后，收集100uL細(xì)胞懸液用細(xì)胞離心涂片器旋轉(zhuǎn)制作載波片， 95%乙醇固定10分鐘。TUNEL法分析載波片上細(xì)胞核DNA斷裂情況。6 免疫組化筆者用免疫組化TUNEL法對(duì)腫瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞記數(shù)。AB1-HA 細(xì)胞1*106個(gè)皮下接種于小鼠側(cè)腹部，每隔兩天觀察腫瘤在鼠體內(nèi)生長(zhǎng)情況，待腫瘤可觸及時(shí)做為day0。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別在day0，1，2，7，8，9，14，15時(shí)向荷瘤小鼠腹膜內(nèi)注射300uLC

14、oramsine（14mg/kg）溶液和生理鹽水稀釋的乙酸（14mg/kg）并在day3，10，17時(shí)分批處死小鼠。將腫瘤從小鼠體內(nèi)完整取出做組織學(xué)切片，層厚約9um。切片用抗CD4，CD8，和B220單克隆抗體染色。用F4-80單克隆抗體檢測(cè)小噬細(xì)胞microphages。TUNEL法分析腫瘤細(xì)胞在鼠體內(nèi)的凋亡情況。7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析T檢驗(yàn)分析不同組別間的數(shù)據(jù)差異。P16mg/kg,每天一次， 該藥有很高比例的死亡率。由此結(jié)果本實(shí)驗(yàn)始終采用用藥3天中斷4天(3days on-4days off)和用藥劑量16mg/kg的治療方案。當(dāng)AB1-HA腫瘤可觸及時(shí), 經(jīng)小鼠(n=5)腹膜內(nèi)注射Coram

15、sine(12mg/kg) ,觀察其抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)果顯示用藥3天中斷4天的時(shí)間方案在治療前兩周可以顯著延緩腫瘤生長(zhǎng)。 (P=0.0027;圖1A)。當(dāng)Coramsine劑量提高到14mg/kg時(shí),重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),P=0.0008.此劑量不僅可顯著延緩腫瘤生長(zhǎng)而且在治療后15天還觀察到腫瘤體積的縮小(圖1A)。當(dāng)用藥停止后,腫瘤恢復(fù)生長(zhǎng)。但在14mg/kg劑量組荷瘤小鼠的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P=0.047）。所有荷瘤小鼠最終都因?yàn)槟[瘤死亡。 圖1：Coramsine腹膜內(nèi)注射延緩了腫瘤生長(zhǎng)。當(dāng)AB1-HA腫瘤可觸及時(shí)，以用藥3天間隔4天的時(shí)間方案往BALB/c荷瘤小鼠腹膜內(nèi)注射不同劑量的Corams

16、ine（12mg/kg或14mg/kg，每個(gè)劑量組n=5），。A，可見治療方案。盲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)速率（A）和生存曲線（B）如圖所示。2 Coramsine對(duì)免疫系統(tǒng)的影響因?yàn)樵S多化療藥物都會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響,使淋巴細(xì)胞記數(shù)降低。本實(shí)驗(yàn)在小鼠模型上觀察Coramsine是否會(huì)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞記數(shù)降低。Coramsine經(jīng)腹膜內(nèi)注射入荷瘤小鼠(n=5,14mg/kg)后,分別于治療開始后第3,10,17天收集脾臟,腫瘤淋巴灌注區(qū),和對(duì)側(cè)淋巴灌注區(qū)的淋巴細(xì)胞并記數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組荷瘤小鼠三個(gè)區(qū)域的淋巴記數(shù)在第3和10天時(shí)輕度降低,第10-17天時(shí)開始升高(圖2A)。而實(shí)驗(yàn)組Cor

17、amsine用藥能夠?qū)е旅庖咂鞴俚牧馨图?xì)胞記數(shù)輕度降低。（圖2A）。筆者進(jìn)一步用熒光標(biāo)記的抗CD3和B220抗體對(duì)Coramsine處理組的荷瘤小鼠免疫器官的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞記數(shù)。結(jié)果顯示Coramsine處理組的T淋巴細(xì)胞總數(shù)也相應(yīng)的有略微降低，對(duì)側(cè)淋巴灌注區(qū)更明顯一些（圖2B）。結(jié)果分析，Coramsine與其他的化療藥物相比如吉西他濱對(duì)免疫系統(tǒng)的影響是非常小的。筆者通過免疫組化方法觀察CD4、CD8 T淋巴細(xì)胞，B細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞表達(dá)，分析Coramsine抑瘤作用是直接抑制腫瘤細(xì)胞還是誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)間接抑制腫瘤細(xì)胞（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整個(gè)治療過程中，Coramsine并沒有明顯改變

18、腫瘤組織中CD4、CD8 T淋巴細(xì)胞，B細(xì)胞表達(dá)（圖2C）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)主要的免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞（圖3）。即使實(shí)驗(yàn)組的腫瘤生長(zhǎng)被Coramsine明顯延緩時(shí)，兩組的腫瘤組織內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量也沒有明顯差異，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Coramsine直接作用于腫瘤細(xì)胞。圖2：Coramsine對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。接種 AB1-HA細(xì)胞的小鼠（n=5）經(jīng)腹膜內(nèi)注射14mg/kg的Coramsine或生理鹽水稀釋的乙酸。A，示Coramsine組和vehicle組在day3，10和17天時(shí)脾臟，腫瘤灌注區(qū)淋巴結(jié)，對(duì)側(cè)淋巴結(jié)細(xì)胞總數(shù)。B，治療開始后，Coramsine組和vehicle組在day3，10和

19、17天時(shí)脾臟，腫瘤灌注區(qū)淋巴結(jié)，對(duì)側(cè)淋巴結(jié)CD3+ T細(xì)胞的頻率。C，治療開始后，Coramsine組和vehicle組在day3，10和17天時(shí)脾臟，腫瘤灌注區(qū)淋巴結(jié)，對(duì)側(cè)淋巴結(jié)B220+ B細(xì)胞的頻率。圖3：Coramsine治療AB1-HA腫瘤對(duì)瘤內(nèi)對(duì)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目的影響。接種 AB1-HA細(xì)胞的小鼠（n=5）經(jīng)腹膜內(nèi)注射14mg/kg的Coramsine或生理鹽水稀釋的乙酸。治療開始后在day3，10和17天收集腫瘤。圖示day10天時(shí)的免疫組化染色。A，對(duì)照組CD4+細(xì)胞B ，實(shí)驗(yàn)組CD4+細(xì)胞C，對(duì)照組CD8+細(xì)胞D，實(shí)驗(yàn)組CD8+細(xì)胞E，對(duì)照組B細(xì)胞F，實(shí)驗(yàn)組B細(xì)胞。G，

20、對(duì)照組巨噬細(xì)胞。H，實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞。陽性細(xì)胞染成褐色。3 在與CpG-containing寡聚脫氧核苷酸聯(lián)用時(shí)，Coramsine的抑瘤作用增強(qiáng)因?yàn)镃oramsine的在BALB/c荷瘤小鼠身上的抑瘤作用與免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抑瘤作用并沒有明顯聯(lián)系并且Coramsine也不會(huì)像其他化療藥那樣導(dǎo)致淋巴細(xì)胞降低，我們探討在Coramsine用藥時(shí)給予免疫治療是否會(huì)增強(qiáng)其抑瘤作用。筆者實(shí)驗(yàn)室先前的研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱與抗原呈遞細(xì)胞（directed 激活CD40）在作用于AB1-HA細(xì)胞時(shí)有很強(qiáng)的協(xié)同作用。在此，我們首先評(píng)價(jià)FGK-45抗CD40免疫治療（FGK-45抗體靜脈注射）配合Coramsine腹膜

21、內(nèi)用藥時(shí)的療效。治療方案大體如圖4A。很明顯，F(xiàn)GK-45單獨(dú)使用時(shí)可以延緩腫瘤生長(zhǎng)（圖4A，P=0.011），與我們先前的研究一致。由圖4B我們可以看到Coramsine的抑瘤作用在用藥的前11天，效果是比較顯著的（P=0.016）。但實(shí)驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)兩者的協(xié)同作用。在腫瘤淋巴灌注區(qū)的啟動(dòng)事件后, FGK-45激活免疫反應(yīng)， 但FGK-45并沒有增強(qiáng)Coramsine的抑瘤作用。說明與吉西他濱相比，Coramsine誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡并非由于其可能激活免疫反應(yīng)。我們利用脂多糖，雙鏈RNA，膽堿磷酸甘油酯ODNs等相關(guān)病原體的炎性刺激能力啟動(dòng)樹突狀細(xì)胞成熟并激活免疫反應(yīng)。假設(shè)這些TLR配體激活免疫

22、系統(tǒng)的信號(hào)有助于Coramsine在腫瘤治療中的作用。本實(shí)驗(yàn)中將評(píng)價(jià)TLR-3(poly I/C),TLR-7(loxoribine),和TLR-9(CpG-containing ODNs)對(duì)Coramsine的協(xié)同作用。我們首先在預(yù)實(shí)驗(yàn)的腫瘤模型中評(píng)價(jià)TLR配體的作用。AB1-HA腫瘤細(xì)胞接種到小鼠（n=4）。當(dāng)腫瘤可觸及時(shí)（day0），開始用藥，每隔3天瘤內(nèi)注射poly I/C，loxoribine， CpG-containing ODNs，和non CpG-containing ODNs，空白對(duì)照組注射PBS。所有小鼠以用藥3天中斷4天的方案經(jīng)腹膜內(nèi)注射Coramsine（14mg/kg

23、）,監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。治療方案如圖5A。引人注目的是，所有接受CpG- Coramsine方案的小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯延緩（p=0.019與PBS組比較，P=0.027與non-CpG組比較.）生存期明顯延長(zhǎng)(P=0.009與PBS組比較,P=0.009與non-CpG組比較). CpG- Coramsine方案治愈一例腫瘤(1/4).如圖5B。相比之下在non CpG- Coramsin組(對(duì)照組),沒有發(fā)現(xiàn)兩者的協(xié)同抑瘤作用.(P=0.45,與PBS組比較，圖5)。我們擴(kuò)展預(yù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)范圍,進(jìn)一步尋找CpG- Coramsin協(xié)同作用的證據(jù).AB1-HA細(xì)胞接種于小鼠體內(nèi)(n=10), Corams

24、ine結(jié)合CpG或non CpG處理小鼠，如圖6所示。當(dāng)Coramsine聯(lián)用CpG時(shí), CpG可以增強(qiáng)Coramsine在延緩腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間方面的作用.兩者聯(lián)用效果明顯優(yōu)于CpG單藥組 (p=0.023), Coramsine+non CpG對(duì)照組(p=0.0024)和PBS組(p=0.019). CpG單獨(dú)用藥時(shí)也可以明顯延緩腫瘤生長(zhǎng) (p=0.015,與non CpG組比較) 。Coramsine聯(lián)用CpG時(shí)可以顯著的延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間, 與空白對(duì)照組(p=0.0015)和Coramsine+non-CpG組(p=0.0018)比較具有顯著性差異(如圖6B)。 但是CpG

25、- Coramsin組的小鼠中位生存期為29天, CpG單獨(dú)用藥組為21天,兩組差異顯著(p=0.01)。圖4：快速篩選不同的TLRs配體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速率（a）和生存曲線（b）的影響。各種不同的TLRs配體（三天一次）結(jié)合Coramsine治療（用藥3天間隔4天）。治療方案如圖a。盲法實(shí)驗(yàn)。圖5，Coramsine結(jié)合CpG ODN用藥可以使治療獲益明顯增加。Coramsine和CpG ODN的協(xié)同作用對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速率（a）和生存曲線（b）的影響。Coramsine（用藥3天間隔4天）結(jié)合CpG ODN或non-CpG（三天一次）作用荷瘤小鼠（n=10）。治療方案如圖a。盲法實(shí)驗(yàn)。討論 本實(shí)驗(yàn)首次

26、通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)闡述了澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的生物堿苷類混合物全身用藥在詰抗實(shí)體腫瘤方面的效應(yīng)。我們通過小鼠惡性間皮細(xì)胞瘤模型評(píng)估了這兩種生物堿苷類混合物（已命名為Coramsine）的抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)證明Coramsine全身用藥可以延緩腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠生存期。但所有小鼠最終都死于腫瘤說明其沒有使小鼠生存獲益。與其他化療藥物相比，Coramsine對(duì)免疫系統(tǒng)的影響較小。Coramsine治療過程中，并沒有淋巴器官中淋巴細(xì)胞記數(shù)的減少也沒有淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)。 Coramsine的抑瘤作用可以被CpG ODNs增強(qiáng)。雖然實(shí)驗(yàn)證明Coramsine和CpG ODNs的協(xié)同作用是明確的但我們目前的

27、數(shù)據(jù)在機(jī)制方面證明兩者的協(xié)同作用尚顯不足。Coramsine和CpG ODNs聯(lián)合用藥與他們單獨(dú)用藥相比可以顯著延緩腫瘤的生長(zhǎng)。相反，當(dāng)Coramsine聯(lián)合CD40的激活因子FGK-45單克隆抗體用藥時(shí)，卻沒有發(fā)現(xiàn)兩者的協(xié)同作用。Coramsine與后天獲得性免疫治療（postlicensing ？）缺少協(xié)同作用的證據(jù)說明Coramsine誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一個(gè)免疫沉默事件。如果Coramsine介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一個(gè)免疫激活事件，在我們先前對(duì)吉西他濱的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中會(huì)發(fā)現(xiàn)APC對(duì)Coramsine治療的增強(qiáng)作用。事實(shí)恰恰相反。事實(shí)上，Coramsine的抑瘤作用可以被CpG增強(qiáng)與上述觀點(diǎn)是一致的。如

28、果Coramsine誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡伴隨著很強(qiáng)的免疫激活信號(hào)（如CpG ODNs），腫瘤局部環(huán)境可由免疫沉默轉(zhuǎn)變成炎性環(huán)境。FGK-45可以增強(qiáng)Coramsine-CpG聯(lián)用時(shí)的療效預(yù)示上述結(jié)論的正確性。我們的數(shù)據(jù)驗(yàn)證了上述事實(shí)。（R.G Van der Most,R.Himbeck,and R.A.Lake,數(shù)據(jù)尚未公布。我們的原始數(shù)據(jù)表明：coramsine引起的免疫休眠期細(xì)胞的死亡與暴露于coramsin間皮細(xì)胞瘤細(xì)胞產(chǎn)生白介素6減少有關(guān)，而吉西他濱能夠誘導(dǎo)白介素6產(chǎn)生。因?yàn)門LRs結(jié)合到樹突狀細(xì)胞可以激發(fā)白介素6的分泌，促使CD8 T-cell 耐受性降低。（facilitate the reversal of