1、實驗二十 日本血吸蟲病實驗室診斷技術日本血吸蟲病是一種人畜共患的寄生蟲病，被世界衛生組織列為全球重點防治疾病之一。它嚴重威脅著疫區人和動物的健康和生命安全，給畜牧業帶來巨大的經濟損失。在我國，本病嚴重流行于長江流域及其以南13個省、市、自治區。家畜如牛、羊、豬感染日本血吸蟲后，不僅禍害自身，更重要的是作為人體血吸蟲病的主要保蟲宿主，為傳播本病起了重要作用。大量調查研究表明，家畜是血吸蟲病流行最主要的傳染源和污染源。控制傳染源是綜合防治疫病、撲滅疫情的重要環節，而控制傳染源的前提是確診傳染源。因此，應用靈敏、快速、經濟的診斷方法確診傳染源，己成為日本血吸蟲病流行病學調查、疫情監測、以及控制其流行

2、和撲滅疫情必需解決的問題，這樣才能做到有的放矢，減少在人力、物力和財力等方面的浪費。當前對于日本血吸蟲病的診斷方法已有大量的報道，根據本科教學的需要，下面介紹幾種本科階段應該掌握或者需要了解的實驗室常用的日本血吸蟲病診斷方法。一、實驗目的及要求1.熟悉日本血吸蟲卵和毛蚴的形態特征。2.掌握血吸蟲病蟲卵檢查方法。3.掌握血吸蟲病毛蚴孵化方法。4.了解血吸蟲病的幾種常見的血清學（免疫學）診斷方法。二、實驗器材(一)病原學診斷1直接涂片法。（1）檢驗材料：新鮮動物糞便；（2）試劑：50%甘油水溶液或普通水；（3）器材：載玻片、滴管、蓋玻片、顯微鏡。2沉淀法。（1）檢驗材料：新鮮動物糞便；（2）試劑:

3、普通水；（3）器材:專用乳白色塑料糞杯、竹筷、銅篩、滴管、金屬環、載玻片、顯微鏡（普通離心機）。3浮集法。（1）檢驗材料：新鮮動物糞便；（2）試劑:普通水、飽和食鹽水、33的硫酸鋅溶液；（3）器材:專用乳白色塑料糞杯、竹筷、銅篩（60目/英寸）、滴管、金屬環、載玻片、顯微鏡。4.毛蚴孵化法。（1）檢驗材料：新鮮動物糞便；（2）試劑：pH約6.8-7.2，溫度約20-30的滅菌自來水(脫氯處理)；（3）器械：專用乳白色塑料糞杯、竹筷、銅篩（40目/英寸）、尼龍篩網兜（260目/英寸）、塑料袋、長頸燒瓶（或三角瓶）（500ml）、脫脂棉、天平、溫箱。(二)血清學(免疫學)診斷1環卵沉淀試驗（COP

4、T）。（1）檢驗材料：新鮮動物血清；（2）試劑：血吸蟲凍干蟲卵、標準陽性血清、標準陰性血清；（3）器材：滴管、載玻片、蓋玻片（24×24mm）、蠟杯（熔蠟用）、玻璃蠟筆、脫脂棉、有蓋盤、酒精燈、溫箱、計數器、顯微鏡。2間接血凝試驗法（IHA）。（1）檢驗材料：動物血清；（2）試劑：生理鹽水、蒸餾水、血吸蟲病血凝抗原、標準陽性血清、標準陰性血清；（3）器材：96孔微量血凝板、25l和100l微量移液器。3膠乳凝集試驗（LA）。（1）檢驗材料：動物血清；（2）試劑：PAPS血吸蟲病快診液、標準陽性血清、標準陰性血清、生理鹽水、蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH7.2）；（3）器材：12

5、×16cm玻璃凝集反應板、25l和100l微量移液器、手術剪刀、潔凈紙、冰箱、中性濾紙（2.5×2.5cm）、2ml一次性注射器。4斑點酶聯免疫吸附試驗（Dot-ELISA）。（1）檢驗材料：動物血清。（2）試劑：三聯斑點酶聯免疫吸附診斷試劑盒（浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所）、生理鹽水、吐溫20、30%過氧化氫。（3）器材：5ml或10ml試管（多支）、試管夾、鑷子、50ml或100ml燒杯（多個）、100ml量筒、溫箱、50ml棕色試劑瓶、25l和100l微量移液器、小紙片多條。5. 免疫印跡試驗。（1）檢驗材料。動物血清。（2）主要試劑。樣本緩沖液：含甘油10ml，2

6、-巰基乙醇5ml，10%SDS 30ml。轉印緩沖液（TB）：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，加水至1000ml。Tris緩沖鹽水（TBS）：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1調pH至7.4。TBS-T液：TBS液內含0.05%Tween-20的TBS液。猝火劑：1%5%BSA或0.1%0.3%Tween-20的TBS液。氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑（C. I. 20470），45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。脫色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。（3）器材。/轉移電泳儀，硝酸纖維素膜，濾紙，剪刀，手套，小尺等。三、實驗方法、步驟和操作要領(一)

7、 病原學診斷1.直接涂片法。糞便中蟲卵數量多時可采用直接涂片法檢查。用滴管在載玻片表面加50%甘油水溶液或普通水12滴，取黃豆大小的被檢糞塊放入液滴內，混勻，剔除粗糞渣，加蓋蓋玻片，顯微鏡下鏡檢蟲卵（見圖20-1）。圖20-1. 日本血吸蟲蟲卵2沉淀法。 日本血吸蟲卵的比重大可沉集于水底，可采用自然沉淀法或離心沉淀法檢出。取糞便2030g、加水成混懸液，經金屬篩（4060孔）或2、3層濕紗布過濾，再加清水沖洗殘渣；過濾糞液在容器中靜置25min，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔1520min換水一次（34次），直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。附：離心沉淀法將上述濾去粗渣的糞液

8、離心（15002000rpm）12min，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復沉淀34次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。3浮集法。利用比重較大的液體（日本血吸蟲卵比重約1.16），使日本血吸蟲蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有兩種：（1）飽和鹽水浮集法。用竹筷取黃豆粒大小的糞便置于浮集瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶）中，加入少量飽和鹽水（比重約1.18）調勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口，但不溢出為止。此時在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15min后，將載玻片提起并迅速翻轉，鏡檢。附：飽和鹽水配制將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內，不斷攪動，直至食鹽不再溶解為止。（

9、2）硫酸鋅離心浮聚法。取糞便約1g，加1015倍的水，充分攪碎，按離心沉淀法過濾，反復離心34次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33的溶液），調勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1min。用金屬環取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。4毛蚴孵化法。毛蚴孵化法是日本血吸蟲病病原學檢查最常用的方法。其操作步驟如下：（1）取新鮮糞便300g，攪拌混勻后分成三份，每份100g。（2）將分好的糞便置于40目銅篩濾杯內，然后將該銅篩放入預先盛好水的糞杯內進行淘洗，淘洗時三上三下，力求將血吸蟲蟲卵全部洗下，除去濾渣。（3）將濾液倒入260目尼龍篩兜，用清水繼續淘

10、洗，至濾水清晰。（4）將網兜內糞樣捏干成團塊包入紙內，放入塑料袋內保濕，在30溫箱中孵育24h。（5）將孵育好的糞樣倒入500ml的長頸燒瓶（或三角瓶）內，加孵化用水至瓶頸處，在燒瓶瓶頸處塞一團脫脂棉（脫脂棉與糞水之間不能留有空氣柱），再加清水至距瓶口12cm處，保持溫度在2226間，進行孵化。（6）分別在開始孵化后1、3、5h各觀察一次,觀察時間2min以上。發現水面下有白色點狀物直線來回運動，即為毛蚴，判為陽性，并記錄。（二）血清學（免疫學）診斷近些年來已將血清學診斷法應用于生產實踐，如環卵沉淀試驗、間接血凝試驗、膠乳凝集試驗和斑點酶聯免疫吸附試驗等。其檢出率可在95%以上，假陽性率在5%

11、以下。1環卵沉淀試驗（COPT）。原理：環卵沉淀試驗（circumovalprecipitintest，COPT）是以血吸蟲全卵為抗原的特異免疫血清學試驗，卵內毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物質經卵殼微孔滲出與檢測血清內的特異抗體結合，可在蟲卵周圍形成特殊的復合物沉淀，在光鏡下判讀反應強度并計數反應卵的百分率稱環沉率。 操作步驟：（1）取載玻片，在其中央橫軸兩側涂兩條平行蠟，蠟間距離與蓋玻片寬度相同。（2）用滴管吸取被檢動物血清12滴（約25l），用針挑取蟲卵約100個，放入血清中，并用針攪拌，使蟲卵散開，蓋好蓋玻片，四周用蠟封閉。（3）將制好的玻片放入濕盒（在有蓋盤中預先放置一層濕紗布），置37溫

12、箱中培養。（4）48h后，取出切片在顯微鏡下觀察，記錄環沉情況，并計算環沉率。判定標準：（1）環沉判定標準。塊狀反應物大于1/8而小于1/2蟲卵面積或索狀反應物大于1/3而小于1/2蟲卵長徑，記為“+”或“+”；塊狀反應物面積大于1/2蟲卵面積或索狀反應物大于1/2蟲卵長徑，記為“+”或“+”。（2）陽性判定標準。環沉率達5%者為陽性。環沉率%=（全片陽性反應卵數/全片蟲卵數）×100%。2. 間接血凝試驗法。原理：間接血凝試驗（indirecthaemagglutinationtest，IHA）是以甲醛和鞣酸處理過的綿羊紅細胞或“O”型人紅細胞為載體，將血吸蟲蟲卵或成蟲抗原吸附于載

13、體上，當受檢動物血清中存在相應的抗體時，紅細胞會因抗原-抗體的結合而被動呈現凝集現象。IHA操作簡便，敏感性高，適于現場使用，可作為輔助診斷病人，流行病學調查及綜合查病方法。操作步驟：（1）用微量移液器在血凝板左邊第一孔、第二孔、第三孔內分別加入生理鹽水100l、25l、25l。（2）在第一孔內加入被檢血清25l，混勻，使血清成15稀釋。（3）吸取25l第一孔的血清液，加入第二孔，混勻，此孔血清成110稀釋。（4）吸取25l第二孔的血清液，加入第三孔，混勻，此孔血清成120稀釋。然后吸取25l此孔血清液丟棄。（5）如有多份樣本，每個樣本均按上述操作處理。（6）陽性對照和陰性對照采用標準血清也按

14、上述操作處理。另外用生理鹽水設空白對照。（7）用移液器吸取血吸蟲病血凝抗原，在各個樣本和對照的110和120的稀釋孔分別加25l，震蕩混勻，置于37條件下。當空白或陰性血清兩孔的血球全部沉于孔底中央（即無圓形紅點或僅有小的圓形紅點）時，即可判定診斷結果。判定標準：（1）反應強度判定。紅血球全部下沉到孔底中央，形成緊密紅色圓點，周緣整齊為陰性“-”。紅血球少量沉于孔底中央，形成一較陰性小的紅色圓點，周圍有少量凝集紅血球為弱陽性“+”。紅血球半數沉于孔底中央，形成一更小的紅色圓點，周圍有一層淡紅色凝集紅血球為陽性“+”。紅血球75%以上散于孔底斜面，形成一層淡紅色薄層為強陽性“+”。紅血球全部凝集

15、，均勻散于孔底斜面，形成一層淡紅色薄層為強陽性“+”。（2）陽性血清判定以血清110稀釋孔出現陽性（包括弱陽性）時被檢血清判定為血吸蟲病畜陽性。3膠乳凝集試驗（LA）。原理：膠乳凝集試驗(latex agglutination test)是以聚苯乙烯膠乳顆粒為載體,將血吸蟲抗原聯結在膠乳顆粒上。試驗時將一定量的聯結有抗原的膠乳試劑加入待檢血清中，如待檢血清中有相應的抗體，則抗原抗體結合，膠乳顆粒發生凝集。操作步驟：（1）在12×16cm玻璃凝集反應板的左邊第一孔中加PBS液100l，第二孔加PBS液25l。（2）在第一孔中加待檢血清25l，混勻，使第一孔成15稀釋。（3）在第二孔中加

16、第一孔稀釋血清液25l，混勻，使第二孔成110稀釋。（4）在每孔中加PAPS快診液25l，混勻，10min后觀察結果。判定標準：（1）反應強度判定。12min內膠乳全部凝集出現粗顆粒，并且四周形成一白色框邊，液體清亮，記為“+”。34min內膠乳全部凝集出現粗顆粒，四周白色框邊不太明顯，液體較清亮，記為“+”。56min內70%80%膠乳出現凝集顆粒，液體微渾濁，記為“+”。810min內40%50%膠乳出現凝集顆粒，液體微渾濁，記為“+”。不出現凝集顆粒，呈白色均勻渾濁狀，記為“-”。（2）陽性血清判定。110 (第二孔)血清稀釋孔出現“+”即判為陽性。4斑點酶聯免疫吸附試驗（Dot-ELI

17、SA）。原理：斑點ELISA（dot-ELISA）是在ELISA技術基礎上發展起來的一種技術，選用對蛋白質有很強吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體，底物經酶促反應后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來檢測抗體，也可用來檢測抗原，由于該法檢測抗原時操作較其他免疫學試驗簡便，故目前多用于抗原檢測。試劑準備：本實驗采用三聯斑點酶聯免疫吸附診斷試劑盒（浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所），試劑盒內有試劑1、2、3、4、5，試劑6、7、8、9、10需現配現用，配置方法如下：試劑6：1包試劑1配500ml生理鹽水，溶解后加入2ml吐溫20，混勻。試劑7：1包試劑2配

18、500ml生理鹽水，溶解后即成。試劑8：量取25ml試劑6倒入燒杯中，將試劑3紙片浸入即成。試劑9：吸取5ml試劑6加入試劑4中，待溶解后倒入燒杯中，再量取20ml試劑6洗試劑4瓶3次，倒入燒杯中，混勻即成。試劑10：量取40ml試劑7倒入燒杯中，將試劑5加入，置37溫箱避光溶解后，取出在室溫下置于避光容器（棕色瓶）中待用。操作步驟：（1）用記號筆在試管上標好待檢血清號碼，用鉛筆在診膜右端遍上待檢血清號碼，用剪刀將膜條剪下，放入相應試管中。（2）分別在每個試管中加入1.5ml的試劑6。（3）分別在各個試管中加4l相應編號的待檢血清，輕輕搖勻。（4）將搖勻的試管置于37溫箱中孵育5060分鐘，每

19、隔20分鐘輕輕搖動試管一次。（5）取燒杯一只，加入約40ml試劑6，用鑷子將每支試管中膜夾出，放入盛有試劑6的燒杯中，每隔2分鐘，輕輕搖動洗滌1次，共計三次。（6）洗滌好的膜用鑷子夾出，放在濾紙上吸去膜表面水后，放入盛有試劑8的燒杯中，用鑷子翻動膜，使其充分接觸液體，然后，置于37溫箱中反應5060min，隔25min用鑷子翻動膜1次。(7) 反應結束后洗滌膜三次，方法同5。(8) 用濾紙吸去膜表面水后，將膜放入盛有試劑9的燒杯中，用鑷子翻動膜，使膜浸在液體中，置于37溫箱中反應40分鐘，隔25分鐘用鑷子翻動膜1次。(9) 反應結束后洗滌膜三次，方法同5和7。(10)用可調微量移液器吸取30%

20、過氧化氫40l，加入盛有試劑10的燒杯中搖勻后，迅速用濾紙吸去膜表面水，放入燒杯中，輕輕搖動，待有任一清晰斑點出現后終止反應。(11)將燒杯中的反應液棄去，用自來水充分洗滌至水清為止。然后判定結果。判定標準：（1）反應強度判定。深棕色為“+”，淺棕色為“+”，黃色為“+”，淺黃色為“+”，稍有黃色為±，無色為“”（2）陽性血清判定。凡出現“+”即判為陽性血清。5免疫印跡試驗。原理：免疫印跡試驗（immunoblot或Westernblot）是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電泳轉印及標記免疫試驗三項技術結合而成的一種新型的免疫探針技術（immuno-probin

21、gtechnique），是用于分析蛋白抗原和鑒別生物學活性抗原組分的有效方法，近年來已應用于檢測寄生蟲感染宿主體液內針對某分子量抗原的相應循環抗體成分或譜型，是一項高敏感和高特異的診斷方法，具有很大發展潛力。用于診斷的免疫印跡試驗以采用酶標記的探針（即二抗及其標記結合物）為安全方便，稱酶免疫轉移印跡試驗（enzymeimmuno-transferblotting，EITB）。操作程序：樣本分離。取日本血吸蟲新鮮成蟲按510對1.5ml比例加樣本緩沖液，勻漿，置沸水浴2分鐘，離心（10000g，30min），取上清液備用。上述成蟲抗原樣本進行單梳SDSPAGE電泳分離。左側梳孔加標準分子量蛋白，

22、梳孔右側樣槽加抗原液，電壓控制在160180V之間。 電泳轉印。從電泳板中取出已完成電泳的凝膠片浸泡于盛有轉印緩沖液（TB）的搪瓷盤內。在TB液內組成轉印夾心板層：取相應大小的硝酸纖維（NC）薄膜，徐徐浸泡在TB液，將凝膠片與薄膜光面緊貼。兩面各放置浸濕濾紙兩層而后海綿墊（厚0.51cm）一層，做好方位標記，最后夾于二層有孔塑料襯板之間，絕對避免各層之間留有氣泡。將TB倒入轉印槽中，然后插入轉印板，使凝膠片位于陰極側，NC薄膜位于陽極側。置轉印槽于4冰箱內，通電轉印數小時或過夜，電流控制在250mA上下（約4050V）。 探針檢測。取出轉印好的NC薄膜，水平地放入猝火劑中，室溫搖動1h以封閉未吸附蛋白質的區域，然后用洗滌緩沖液選23次，每次30min以除去變性劑，使蛋白質的天然狀態和生物學特性得以恢復。平置NC薄膜于浸有Tris-緩沖鹽水（TBS）的濾紙上，用刀片將薄膜按電泳方向分割為寬約