1、鼠疫實驗室檢測技術鼠疫實驗室檢測技術鼠疫實驗室檢測鼠疫實驗室檢測針對病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測：鼠疫菌的染色檢查；鼠疫菌的培養及鼠疫噬菌體試驗；鼠疫菌的生化檢查、營養需求、毒素檢測、毒力測定等。針對病原體特異性抗原結構的檢測：鼠疫F1抗原抗體檢測；鼠疫菌外膜蛋白的檢測。針對病原體遺傳基因的檢測：鼠疫菌的質粒檢測；鼠疫菌特異性核酸片斷的檢測；鼠疫菌全基因組測定；插入序列的檢測。一、鼠疫菌菌體形態檢查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長12m，寬，寬0.50.7m,中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。

2、的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。革蘭氏染色陰性。染疫動物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓染疫動物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓印片，可見到兩端鈍圓、兩極濃染的典型鼠疫印片，可見到兩端鈍圓、兩極濃染的典型鼠疫菌。壓印標本中可在吞噬細胞內外見到鼠疫菌，菌。壓印標本中可在吞噬細胞內外見到鼠疫菌，對于鑒別雜菌污染材料極有價值。對于鑒別雜菌污染材料極有價值。鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明顯）、姬姆薩染色（菌體染成色，莢膜染成色）顯）、姬姆薩染色（菌體染成

3、色，莢膜染成色）鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片)美蘭染色革蘭氏染色鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革蘭氏染色鼠疫菌染色檢查Wayson stain(魏申氏染色)呈現的兩極濃染特征莢膜染色墨汁負染色二、鼠疫菌的培養特性u鼠疫菌是典型的異養菌。鼠疫菌是典型的異養菌。u鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。u鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養的最適溫度為鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養的最適溫度為28，最適，最適pH為為6.9-7.1，發育初期的最適氧化還原電位（，發育初期的最適氧化還原電位（Eh）約為）約為100150mV，接種后至少，接種后至少20h以上才能形成肉眼可見的菌落，以上才能

4、形成肉眼可見的菌落，一般一般2448h形成肉眼可見的小菌落。形成肉眼可見的小菌落。u強毒鼠疫菌對鈣離子有半依賴性，缺乏時生長不良。強毒鼠疫菌對鈣離子有半依賴性，缺乏時生長不良。37缺鈣缺鈣條件下強毒鼠疫菌生長受限并釋放大量條件下強毒鼠疫菌生長受限并釋放大量Yops,表現很強的表達和表現很強的表達和分泌毒力蛋白分泌毒力蛋白V抗原（抗原（LcrV）。此現象稱為低鈣反應，受）。此現象稱為低鈣反應，受70kb(45MD)質粒上的遺傳基因控制。質粒上的遺傳基因控制。u典型鼠疫菌培養典型鼠疫菌培養18-20h光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養24h以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶

5、淡青色，反射光線下菌落以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶淡青色，反射光線下菌落圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發暗，有黃褐色粗糙顆圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發暗，有黃褐色粗糙顆粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的花邊。花邊。鼠疫噬菌體試驗在培基上密集平行劃線培養鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于上端劃線中部，直立平板，使噬菌體液垂直劃線自然流下，置20培養24h,有明顯的噬菌帶。在1822鼠疫噬菌體只能裂解鼠疫菌而不裂解假結核菌，具有較強的專一性(噬菌作用具有種的特異性)，是鼠疫細菌學診斷中特異的鑒定方法之一。鼠疫噬菌體試驗可

6、快速診斷鼠疫菌。對被檢材料作細菌分離培養的同時作噬菌體裂解試驗，20h左右即可獲得結果。分離到鼠疫噬菌體，可以間接判定檢材中存在鼠疫菌。鼠疫菌培養及鼠疫噬菌體試驗典型鼠疫菌菌落形態噬菌帶鼠疫菌培養及鼠疫噬菌體試驗鼠疫菌培養特征鼠疫噬菌體試驗三、鼠疫F1抗原、抗體檢測鼠疫F1抗原檢測1.反向血球凝集試驗(RIHA)2.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)4.免疫熒光技術(IFT)鼠疫F1抗體檢測1.間接血球凝集試驗(IHA)2.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)間接紅血球凝集試驗(IHA)鼠疫菌特異性F1抗原致敏經單寧酸鞣化處理的醛化綿羊紅血

7、球，制備成F1抗原致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗體。試驗方法和結果判定均為常規操作。IHA微量法結果：反向血球凝集試驗(RIHA)用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗原。試驗方法和結果判定與IHA相同。RIHA微量法結果：酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測抗體測抗體.雙抗原夾心法：雙抗原夾心法：F1抗原包被反應板，抗原包被反應板，加入待測標本加入待測標本28反應反應1.5h洗板，洗板，加入加入HRP-F1抗原抗原28反應反應1h洗板，洗板，加入底物加入底物OPD蔽光反應蔽光反應30min后加后加終止液終止液(2mol/L硫酸硫酸)。間接法：間接法： 已知已知F1抗原包被反應板，抗原包被反應板

8、，加標本加標本37反應反應1h洗板，加入酶標洗板，加入酶標二抗二抗37反應反應1h洗板，加入底物洗板，加入底物(如如OPD或或TMB)蔽光反應蔽光反應30min顯顯色后加終止液。色后加終止液。用肉眼觀察結果并用酶標儀檢測每用肉眼觀察結果并用酶標儀檢測每孔的吸光度值孔的吸光度值(A)測抗原雙單抗夾心法：雙單抗夾心法： F1-McAb包被反應包被反應板，加入標本板，加入標本28反應反應1.5h洗板，加洗板，加入入HRP-F1McAb 28反應反應1h洗板，洗板，加入底物加入底物OPD蔽光反應蔽光反應30min后加終后加終止液。止液。雙抗體夾心法雙抗體夾心法(改良法改良法-美國美國CDC鼠疫鼠疫診斷

9、技術實驗室操作手冊診斷技術實驗室操作手冊)：鼠疫免疫：鼠疫免疫血清特異性抗體血清特異性抗體( F1Ab)包被反應板，包被反應板，加標本加標本37反應反應1h洗板，加小鼠洗板，加小鼠F1McAb 液液37靜置靜置1h洗板，加洗板，加HRP標記的羊抗小鼠標記的羊抗小鼠IgG 37反應反應1h洗板洗板,加底物加底物OPD蔽光反應蔽光反應30min顯色，顯色，加終止液。加終止液。肉眼觀察結果并用酶標儀檢測每孔的肉眼觀察結果并用酶標儀檢測每孔的吸光度值吸光度值(A) 膠體金免疫層析法(GICA)檢測鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標技術以GICA廣泛用于實踐。基本原理均為夾心法。雙抗體夾心法測抗原：固定于NC

10、膜上的單抗(F1McAb)+標本中待測抗原(F1Ag)+金標記的另一株單抗(金標-F1McAb)顯色。雙抗原夾心法測抗體：雙抗原夾心法測抗體：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+標本中待測抗體(F1Ab)+金標記的F1抗原(金標-F1Ag)顯色。夾心法測抗體：固定于膜上的鼠疫固定于膜上的鼠疫F1抗原標抗原標本中的相應抗體金標記的本中的相應抗體金標記的SPA顯色。顯色。GICA雙抗體夾心法測抗原G區：金標特異性抗體(鼠型F1McAb)C區：羊抗小鼠IgT區：特異性單克隆抗體(F1McAb) 吸水紙標本標本免疫熒光技術(IFT)標記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC)熒光素標記抗體檢測相應抗

11、原-直接法：如FITC-FIMcAb為異硫氰為異硫氰酸熒光黃標記鼠疫酸熒光黃標記鼠疫F1單克隆抗體。單克隆抗體。方法：固定好的玻片標本用方法：固定好的玻片標本用1%牛牛血清血清PBS浸洗浸洗5分鐘，流水沖洗。分鐘，流水沖洗。用用FITC-FIMcAb適量（適量（0.2ml）熒）熒光染色，室溫作用光染色，室溫作用30分鐘，流水分鐘，流水沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀察，鼠疫菌染上翠綠色熒光察，鼠疫菌染上翠綠色熒光Yersinia pestis 免疫熒光染色Fluorescence antibody positivity is seen as bright, intens

12、e green staining around the bacterial cell 鼠疫菌特異性基因片斷檢測PCR目標基因目標基因：鼠疫菌的鼠疫菌的fra和和pla特異性基因片段特異性基因片段引物序列和擴增產物的長度引物序列和擴增產物的長度目標基因目標基因 引物序列引物序列 產物長度產物長度 fra 1F 5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3 249 bp 1R 5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3 pla 2F 5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3 456 bp 2R 5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3內部對照：以鼠疫菌

13、內部對照：以鼠疫菌EV株株DNA為模板，采用上述為模板，采用上述f1引物擴引物擴增出增出fra基因基因249 bp片段，再以片段，再以16SrRNA基因引物：基因引物： F 5-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3 R 5-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3 擴增出擴增出16SrRNA基因基因396bp片段加載體重組而成，產物片段加載體重組而成，產物長度長度645 bp ，使用了內部對照，可有效的防止假陰性結果。，使用了內部對照，可有效的防止假陰性結果。應用多重應用多重PCR方法來檢測鼠疫菌，所選取的擴增區域都為鼠方法來檢測鼠疫菌，所選取的擴增區域都為鼠疫菌的特異區域，可有效

14、地將鼠疫菌與其它細菌相鑒別，具疫菌的特異區域，可有效地將鼠疫菌與其它細菌相鑒別，具有較高特異性。有較高特異性。鼠疫PCR反應體系PCR反應體系反應體系(總量總量25l)采用其它總量時，采用其它總量時，下列配方按比例改變。下列配方按比例改變。 無菌去離子水無菌去離子水 13.5l10反應緩沖液反應緩沖液 2.5l4dNTP混合物（每種混合物（每種2.5mM） 2l引物（引物（1F、1R、2F、2R） 各各1l 內部對照模板內部對照模板(IC) 1l待測標本待測標本 1lTaq DNA 聚合酶聚合酶 1l鼠疫PCR反應條件反應條件(擴增擴增) ：預變性預變性95 5min，1個循個循環；然后環；然

15、后95 1 min，55 1 min，72 1 min，30個循環；最后個循環；最后72 5 min。共。共1小時小時40分。分。電泳：反應管中加溴酚藍指示劑電泳：反應管中加溴酚藍指示劑5l，混均短，混均短暫離心。膠體的每一孔中加入上述處理的反暫離心。膠體的每一孔中加入上述處理的反應產物應產物8l，在，在80-100V(不超過不超過5V/cm)電壓電壓下下TBE緩沖液中電泳約緩沖液中電泳約1小時。凝膠成像儀讀小時。凝膠成像儀讀取結果并照相。取結果并照相。多重PCR擴增結果鼠疫PCR 內部對照質粒與不同濃度EV菌 PCR擴增結果 鼠疫多重PCR 多重PCR擴增結果鼠疫菌質粒檢測鼠疫菌的三個尋常質

16、粒： pPCP1 6Mda(9.5kb)編碼鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞漿素原活化因子； pCD145 Mda(70kb)編碼型分泌系統的質粒，即主要編碼低鈣反應并表達LrcV及一系列耶爾森菌特有的Yops； pMT1 65Mda(100kb)編碼F1抗原和鼠毒素。91001全基因組測序新發現的質粒：pCRY長度21742bp，具有獨立復制能力，有一群編碼型分泌系統的基因。質粒DNA提取-堿裂解法和熱裂解法質粒電泳分析鼠疫菌研究進展u傳統的病原體分類傳統的病原體分類(classification)和鑒定和鑒定(identification)方法方法:1.病原體的形態特征病原體的形態特征2.生長特征生長特征(培養特性培養特性)3.血清學反應血清學反應4.生化特征生化特征u基因分類基因分類(Genotyping)和鑒定方法和鑒定方法:多是基于多是基于PCR和核酸凝膠電泳技術，通過電泳條帶模式比和核酸凝膠電泳技術，通過電泳條帶模式比較分析，揭示基因組成間差異。較分析，揭示基因組成間差異。AFLP擴增片段長度多態性擴增片段長度多態性 R