1、王圓生物制藥13132013040928中文名稱(chēng)：L-絲氨酸 外文名稱(chēng)： L-Serine中文別名：L-2-氨基-3-羥基丙酸 分子結(jié)構(gòu)：分子式:C3H7NO3 分子量:105.09物性性質(zhì)1. 性狀：有左旋體和消旋體兩種，左旋體是白色六角棱柱狀晶體，味甜；消旋體是白色單斜棱柱狀晶體。2. 密度（g/mL,25/4）：1.4153. 相對(duì)蒸汽密度（g/mL,空氣=1）：未確定4. 熔點(diǎn)（C）： 223228(分解)5.溶解性：左旋體，溶于水，不溶于無(wú)水乙醇和乙醚；消旋體。略溶于水，不溶于無(wú)色乙醇、乙醚。主要用途1.作生化試劑和食品添加劑。2.營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，在化妝品中作為皮膚營(yíng)養(yǎng)添加劑。3. 可供

2、生物化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究之用，也可作為合成環(huán)絲氨酸的原料。原理本項(xiàng)目主要研究絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化甘氨酸生成L-絲氨酸。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）在生物體內(nèi)是由GlyA 基因編碼的，此酶能在四氫葉酸(THF)、甲醛及磷酸吡哆醛5-PLP 存在下，催化甘氨酸生成L-絲氨酸。其反應(yīng)過(guò)程右圖所示。材料、試劑、儀器：1、原料：細(xì)菌破碎上清液2、主要試劑甘氨酸、甲醛、四氫葉酸、氯化鈉、葡萄糖、無(wú)水乙醇、氯化鈣、氫氧化鈉3、主要儀器電子天平，無(wú)菌超凈工作臺(tái)，高速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱方法1、甘氨酸濃度確定：在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至終濃度分別為6 mmol/L、

3、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L和14mmol/L，再加入甲醛至終濃度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至終濃度0.5mmol/L，四氫葉酸至終濃度5 mmol/L，37，190rpm搖床反應(yīng)16h。反應(yīng)液進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。2、甲醛濃度確定：在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集的上清酶液100ml，加入甲醛至終濃度分別為0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L和20mmol/L，再加入甘氨酸至終濃10mmol/L，磷酸吡哆醛至終濃度0.5mmol/L，四氫葉酸至終濃度5 mmol/L，37，190rpm搖床反應(yīng)16h。反應(yīng)液進(jìn)行L-絲氨

4、酸濃度測(cè)定。3、磷酸吡哆醛濃度確定：在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集的上清酶液100ml，加入磷酸吡哆醛至終濃度分別為0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1mmol/L，再加入甘氨酸至終濃度10 mmol/L，甲醛至終濃度10mmol/L，四氫葉酸至終濃度5 mmol/L，37，190rpm搖床反應(yīng)16h。反應(yīng)液進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。4、 pH確定：在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至終濃度為10 mmol/L，再加入甲醛至終濃度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至終濃度0.5mmol/L，四氫葉酸至

5、終濃度5 mmol/L，并調(diào)節(jié)不同的pH為6.0,7.0,8.0,9.0,10.0，37，190rpm搖床反應(yīng)16h。反應(yīng)液進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。5、 反應(yīng)時(shí)間確定：在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至終濃度為10 mmol/L，再加入甲醛至終濃度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至終濃度0.5mmol/L，四氫葉酸至終濃度5 mmol/L，37，190rpm搖床反應(yīng)時(shí)間分別為0h,8h,16h,24h,36h。反應(yīng)液進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。原理薄層層析是一種微量而快速的層離方法。這種層析方法是把吸附劑如氧化鋁或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金屬等）形成薄層，把

6、要分析的樣品溶液滴加到薄層的一端，然后在此薄層上用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行展開(kāi)即為薄層層析。本實(shí)驗(yàn)中硅膠作為一種固相支持物，它與水有較強(qiáng)的親和力而與有機(jī)溶劑親和力較弱。層析時(shí)吸著在硅膠上的水是固定相，而展層溶劑是流動(dòng)相。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開(kāi)。材料 1儀器薄層板：615cm（2）、毛細(xì)管（4）、燒杯50mL（1）、藥匙（1）、量筒10mL（1）、小尺子（1）、層析缸（1）、電吹風(fēng)（1）、噴霧器（1）、烘箱（200）2. 試劑（1） 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液，制備下列各氨基酸的11.76mol/L(90%)異丙醇溶液各10mL。 0.01mol/L精氨酸：稱(chēng)取精氨酸

7、17.4mg溶于11.76mol/L(90%)異丙醇溶液至10mL 0.01mol/L甘氨酸：稱(chēng)取甘氨酸7.5mg溶于11.76mol/L(90%)異丙醇溶液至10mL。 0.01mol/L丙氨酸：稱(chēng)取丙氨酸8.9mg溶于11.76mol/L(90%)異丙醇溶液至10mL。 （2）硅膠G（C.P.,層析用）。 （3）粘合劑：0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）:取CMCNa5g溶于1000mL蒸餾水中，然后煮沸，靜置冷卻，棄沉淀，取上清液備用。（4）層析溶劑：正丁醇（分析純）冰醋酸（分析純）水602020（V/V），臨用時(shí)配制。 （5）顯色劑：0.025mol/L(0.5%)茚三酮-丙酮溶液:

8、稱(chēng)取茚三酮（A.R.）0.5g溶于無(wú)水丙酮（A.R.）至100mL。 （2）硅膠G（C.P.,層析用）。 （3）粘合劑：0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）:取CMCNa5g溶于1000mL蒸餾水中，然后煮沸，靜置冷卻，棄沉淀，取上清液備用。（4）層析溶劑：正丁醇（分析純）冰醋酸（分析純）水602020（V/V），臨用時(shí)配制。 （5）顯色劑：0.025mol/L(0.5%)茚三酮-丙酮溶液:稱(chēng)取茚三酮（A.R.）0.5g溶于無(wú)水丙酮（A.R.）至100mL。步驟 1、制板稱(chēng)取層析用的硅膠G3g加9mL0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）,在燒杯中調(diào)成均勻糊狀，迅速地傾在1塊615cm的玻璃板上

9、（玻璃板要清潔平整，無(wú)油污），小心將玻璃板輕輕振蕩和傾斜，使硅膠均勻鋪在玻璃板上。室溫下靜置半小時(shí)，移至105烘箱中烘烤1h，選擇厚薄均勻平整的板使用。 （活化：制得的硅膠板如果長(zhǎng)時(shí)間暴露在外面，在使用前應(yīng)放入110烘箱中烘烤30分鐘，去除水分。）2、點(diǎn)樣：活化后的硅膠板室溫冷卻后，在距底邊2cm水平線(xiàn)上以間距1cm的寬度確定4個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)（注意點(diǎn)樣點(diǎn)盡量靠近板中心），用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品溶液，垂直輕輕接觸薄層表面，每次加樣后原點(diǎn)擴(kuò)散直徑大約2-3mm，干后再點(diǎn)一次。 3、展層：將薄板有樣品的一端浸入擴(kuò)展劑，擴(kuò)展劑液面應(yīng)低于點(diǎn)樣線(xiàn)。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿達(dá)薄板3/4高度時(shí)，停止展層

10、，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線(xiàn)，用熱風(fēng)吹干。 4、顯色：用噴霧器將茚三酮溶液噴灑在薄板上（注意噴霧器和薄板要保持一定距離，不要使硅膠層吹散，且應(yīng)噴灑均勻），用熱吹風(fēng)吹干（或置于105烘箱中烘干），即可觀(guān)察到紫紅色的氨基酸斑點(diǎn)。用鉛筆圈出氨基酸斑點(diǎn)，量出溶劑前沿的距離及各斑點(diǎn)中心與起點(diǎn)之間的距離，并計(jì)算各氨基酸的Rf值。Rf值為遷移率（rate of flow, Rf），在恒定條件下，每種氨基酸有其一定的Rf值。 注意事項(xiàng)1.由于硅膠的機(jī)械性差，必須加入粘合計(jì)如煅石膏、淀粉或羧甲基纖維素鈉（CMCNa），其中以羧甲基纖維素鈉的效果為最好。市售的硅膠G和氧化鋁G均已含有粘合劑（煅石膏），可直接加水調(diào)勻后鋪層，但效果稍差。加粘合劑的薄層板常稱(chēng)硬板，不加粘合劑的薄層板常稱(chēng)為軟板。2在操作過(guò)程中，手必須洗凈，只能接觸薄板上層邊角；不能對(duì)著薄板說(shuō)話(huà)，以防唾液掉在板上。3配制展層劑時(shí)，要用純?nèi)軇?，?yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，以免放置過(guò)久其成分發(fā)生變化（酯化）。4. 層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過(guò)氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過(guò)