1、2011 年 第 56 卷 第 27 期：2289 2297中國科學雜志社SCIENCE CHINA PRESS 評 述青曾慶平,生物學及代謝工程研究進展中管理局原蟲與, 廣州 510405;大學熱帶醫學, 廣州 510405 廣州中: qpzeng2011-06-03 收稿, 2011-08-08 接受自然科學基金(30870072, 30672614)和留學回國科技活動擇優項目(2009 年度)資助摘要青途徑重建, 在生物途徑僅見于青生物(如酵母)中但其“上游”途徑為生物所共有, 可望通過“下游”青. 過去 10 年來, 青青 酸及雙氫青 酸等青被國內外研體. 由于酵的唯一青酵母工程菌轉青

2、生物學代謝工程究團隊陸續克隆并導入釀酒酵母細胞, 已母缺乏適宜的細胞環境, 尚不能將青體轉變成青. 因此, 青 依然是青來源, 凸顯出繼續開展青 種質遺傳改良的必要性. 我國科學家采用“開源”或“節流”等策略,已相繼培育出多種轉青 植株或品系, 為實現青的高產、穩產奠定了堅實的基礎. 同時, 青生物的限速步驟尤其是終端反應機制已基本得到闡明, 有助于開展青形成與積累的環境模擬及仿生, 從而為徹底緩解青的供求創造先機. 本文最后討論了產青體微生物專利的作用及中國避免這些專利壁壘的方法.青(artemisinin)是中國科學家于 20 世紀 70開展了青生物學及代謝工程研究, 一方面途徑5,年代從

3、傳統中草藥青 或稱黃花Artemisia annua嘗試在微生物體內重建青方面對青 中原有的青改良6.生物生物另一L.)中分離提純的抗瘧有效單體, 其化學本質是含有“過氧橋”結構(1,2,4-三噁烷環)的倍半萜內酯1. 以青途徑進行遺傳母核經人工半獲得的青琥酯)、青甲醚(甲醚)、青琥珀酸酯(青乙醚(乙醚)在 Bill & Melinda Gates 基金贊助下, 由 One World Health 非贏利組織主導, 在 Amyris Biotechno- logies 公司和 Sanofi-Aventis 公司參與下, 美國加州大類, 血中溶解性好, 生物和雙氫青等青利用度高, 對氯喹抗性瘧

4、疾及致命性腦型瘧有特效,學伯克利分校 Keasling 研究小組會同植物生物已成為世界衛生組織(WHO)倡導的“基于青的聯技術產青Covello 研究小組, 于 2004 年啟動了以高合療法”(artemisinin-based combination therapies, ACTs)酵母工程菌構建為目標的“青項目” (The首選的抗瘧新藥, 其中青 琥酯、 甲醚及方已被列入 WHO “基本藥品目錄”2.甲醚復Artemisinin Project).及雙氫青 酸等青該項目實施至今已獲得產青 酸體的工程酵母菌7.青分布地域狹窄, 青含量低(0.01%, 迄今仍無法將修飾酵母菌所產青0.5%).

5、 化學全球瘧疾 逐年升高3,青產率不理想, 成本高. 隨著素前體轉變成青, 表明在青 中開展轉研(3.8 億人/年)和率(4600 萬人/年)究仍然是一個不可忽略的重要方向, 為此已育成青青 植株或品系8. 同時,青類抗瘧藥需求量迅猛增長, 導致含量大幅提高的轉青原料藥供不應求, 市場價格飆升4. 近 10 年來,英國約克大學的 Bowles 小組已繪制出青 的遺傳圖為了從根本上解決青的供需, 國內外爭相譜, 并鑒定出青高產相關, 為指導青高).Sci Bull英文格式: Zeng Q P, Bao F. Research achievements in the synthetic biolo

6、gy and metabolic engineering of artemisinin (in(Ver), 2011, 56: 22892297, doi: 10.1360/972011-11192011 年 9 月第 56 卷第 27 期產育種提供了科學依據9.含量通常比雙氫青 酸的含量低 510 倍, 最大相差倍21.15因此, 雙氫青 酸向青如果說青瞻性, 在未來可能取得生物學研究具有 性成果, 那么青性和前轉的轉變很可能是青的“瓶頸”, 此過程涉及雙氫青 酸氫研究則更有現實意義, 因為其成果是優良的青質. 值得強調的是, 中國科學家不僅在青種生過氧化物生成的限速反應. 若以雙氫青 酸為

7、青的直接前體, 則青物學及代謝工程領域取得若干成果,素生物可以人為地劃分成 3 個階段: 第一階段是而且正在引領著世界高產青轉青 植株培育的新潮科學研究上的生物學及代謝工程研從乙酰輔酶 A 經烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙流,勢.充分發揚了中國在青本文擬對當前青基焦磷酸(DMAPP)、法呢基焦磷酸到紫穗槐-4,11-二烯的途徑, 其中 DMAPP 與 IPP 受 IPP 異構酶究的最新進展進行初步評述.(IPPI)催化發生互變, 二者再被法呢基焦磷酸酶(FDS)作用生成法呢基焦磷酸, 并在紫穗槐二烯合酶(ADS)催化下閉環產生紫穗槐-4,11-二烯; 第二階段是從紫穗槐-4,11-二烯到雙氫

8、青 酸的 途徑, 紫穗槐 -4,11- 二 烯在細胞 色素 P450 單 加氧酶 1青生物研究歷史與現狀早在 20 世紀 80 年代, 中國上海有機化學的研究小組就利用放射性同位素標記的 2-14C-青 酸與青 勻漿(無細胞系統)保溫法證明, 青 酸和青 B 是青 的共同前體10. 該結論相繼得到放射性標記青 酸飼喂實驗11、青(CYP71AV1)催化下, 經連續氧化依次生成青、青 醛和青 酸, 其中青 醛受青 醛雙鍵還原酶2(DBR2)催化而還原成雙氫青 醛, 后者再在青 醛脫氫酶 1(ALDH1)催化下氧化成雙氫青 酸. 雙氫青轉變成雙氫青 醛由 ALDH1/CYP71AV1 催化,其逆反

9、應則由雙氫青 酸還原酶 1(RED1)催化; 第三B 離體轉化實驗12和青酸、青B、雙氫也有不支持青B 離體轉化實驗13的支持. 當然,體結論的實驗結果14.青 酸是青大學植株后發小組用 15-2H313C-青 酸飼喂青階段是從雙氫青 酸到青的途徑, 雙氫青酸經過未知的多個非酶促反應最終生成青. 此外,現, 青 酸的代謝產物中僅能檢測到 11,13-脫氫倍半B 后再轉變成青途徑22.青素.酸可能反應青生物萜類(如青 酸、青B/脫氧青B、青 內酯/圖 1 為最新提出的青烷等), 而未檢測到 11,13-二氫倍半異青 內酯萜類(如雙氫青 酸、雙氫青 酸氫過氧化物、青2青從萜類體工程菌的構建素等)1

10、5.因此, 有人認為, 目前還不能完全排除其他中間產物作為青直接或間接前體的可能性.的角度, 可以將青生物分這些化合物包括: 青 酸、青B 和青B、seco-烯、表- 烷和青為從乙酰輔酶 A 到法呢基焦磷酸的“上游”途徑、從法呢基焦磷酸到雙氫青 酸的“中游”途徑和從雙氫青B 和二氫-表-青脫氧青烯16.然而,的“下游”途徑. 青 及其他高等植物酸到青與酵母等荷蘭瓦格林根大學的 Quax 小組從青 中生物法呢基焦磷酸的酶促反應分離出雙氫青 酸及雙氫青 酸氫過氧化物, 并提出雙氫青 酸經雙氫青 酸氫過氧化物生成青完全相同(循甲羥戊酸途徑), 因而只需在酵母中額外代謝支路, 就能讓酵母增加一個青的新

11、觀點17,18.巧合的是, 韓國科學家發現,青. 目前, 中游途徑的酶促反應已通過導入青雙氫青中可能途徑,酸與青 酸之間不能互變19, 意味著青ADS, CYP71AV1, CPR, DBR2 和 ALDH1 等至酵同時C11,13青酸途徑和雙氫青酸母而得以完全重建, 但下游途徑的反應條件在酵母中則尚未建立.位的氧化還原狀態是生成青酸還是雙氫青 酸的“分水嶺”. 換句話說, 若產生青 酸, 則不回溯到 2003 年, 美國 Keasling 小組將青ADS能繼續轉變成青; 若產生雙氫青 酸, 則能最終經子優化后導入大腸桿菌中表達, 同時用獲得青青 中一致20. 這個結論正好與Bouwmeest

12、er 小組發現酵母萜類途徑代替大腸桿菌萜類途徑, 首體著青化學型和青酸化學型的結果次在細菌體內出青的第一個他們的研究結果還顯示,紫穗槐-4,11-二烯, 在 6 L 發酵罐中培養 60 h 的產率青 中青的2290 評 述達到 450 mg/L23. 2006 年, 他們將 ADS連同CYP71AV1 和 CPR同時導入釀酒酵母中表達, 培育出世界上第一株生產青 酸的酵母工程菌,謝途徑修飾與優化, 其產率已達 153 mg/L24. 加拿大 Covello 小組于 2008 年將新克隆的青DBR2連同 ADS, CYP71AV1 和 CPR一同導入釀酒酵母,雙氫青 酸的酵母工程菌, 其中雙氫率

13、先培育出青 酸產率為 15.7 mg/L, 青 酸產率為 11.8 mg/L25.中國醫學小組將青及北京協和醫科大學的 子優化ADS按酵母偏愛并導入釀酒酵母后, 也培育出產紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌26. 瑞典卡爾馬大學的 Brius 小組將ADS導入酵母中, 分別獲得質粒表達及整合表達的產紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌, 其中質粒表達酵母工程菌培養產量為 0.6 mg/L27.然而, 到目前為止, 將酵母工程菌中的青因可能是酵母不具備青16 d 后的紫穗槐-4,11-二烯國內外還沒有一個研究小組體轉變成青, 其原所需要的細胞環境. 在青 葉片表面具有特殊Covello 小組的研究顯

14、示,腺體結構并充滿揮發性芳香油的腺毛(glandular tri-chome)細胞中, 青酶高表達, 暗示青素生物可能就發生在腺毛細胞中28.大學小組給青 飼喂標記雙氫青 酸后并未測得標記青, 推測腺毛油相環境缺乏可能影響了分子中羥基的穩定性29. 在無腺毛的環境中, 青中特有的過氧化基團可能烷化蛋白質而檢測不到青. 作為佐證, 我們發現青可與腫瘤細胞或細菌的一氧化氮合酶及過氧化氫酶的血紅素輔基結合而使酶失活, 導致一氧化氮水平降低, 過氧化氫水平升高30,31.這里著一個策略選擇, 即在微生物中青體后是改用化學方法半青, 還是的方繼續探索讓微生物將青體轉變成青法? 現在看來, 國外選擇的是前

15、者, 并且已先期啟動進程. 不過, 從工藝、成本、等方面考慮, 實現青應用價值.的微生物無疑有著更大的33.1高產青尋找高產青轉青植株的培育青培育的有效途徑圖 1 青生物途徑實線箭頭表示已被證實的反應步驟, 虛線箭頭表示推測或未被證實的反應步驟; 粗線箭頭表示主要反應步驟, 細線箭頭表示次要反應步驟; 單箭頭表示一個反應步驟, 多箭頭表示多個反應步驟轉青是一種次生代謝產物, 它在青 中的積22912011 年 9 月 第 56 卷 第 27 期青高產的先決條件40,41.累量很小, 而且不同地區類型的差異很大. 中國植物春研究小組最早開展轉3.3利用異種植物創建青生物新支路ADS體信號序紫穗槐

16、-青研究, 他們將重組法呢基焦磷酸酶美國肯塔基大學的 Chapel 小組將青(FPS)導入青以增加 FPS的拷貝數目, 期望及鳥類 FPS導入煙草中表達, 經生物途徑的碳流(“開源法”), 由此獲增大青得青列引導, ADS 和 FPS 被轉運至體, 并含量比對照高 34 倍的轉青青發根植株4,11-二烯, 產量達到 25 g/g 鮮重42. 如果將來能將(0.2%0.3%)32及比對照高 23 倍的轉青“途徑“搬到”體內, 那么這種獨特的(0.8%1%)33,34. 類似地,戊二酰輔酶A 還原酶科學家用重組羥甲基體催化”方法可能比常規的“細胞質催化”方法(HMGR)培育轉青 植更能獲得高產青.

17、荷蘭 Bouwmeester 小組利用煙草表達青株, 其青含量提高 22.5%35.本課題組將反義鯊烯合酶ADS,(asSS)導入青FPS 和 HMGR, 獲得產紫穗槐-4,11-二烯的轉基以阻斷競爭青生物的類固醇分支途徑(“節因煙草. 但是, 當繼續導入 CYP71AV1 后, 卻未檢測到預期產物青 酸, 而只檢測到青 酸-12-雙葡萄糖苷, 產量達到 39.5 mg/kg 鮮重, 推測其為煙草流法”), 獲得類固醇含量比對照(0.08%鮮重)下降近一半(0.04%0.05%鮮重)及青含量比對照(0.45%植株36.干重)提高近 3 倍(1.23%干重)的轉青葡萄糖基轉移酶的催化產物43.將

18、青ADS 和 CYP71AV1Covello 小組導入煙草后, 只檢出上海交通大學唐克軒小組利用發夾RNA 介導的RNA干擾技術阻斷類固醇途徑, 使轉青 中的紫穗槐-4,11-二烯和青入 DBR2 和 ALDH1, 未檢出青 酸. 若再導也只檢出雙氫青, 未檢比對照提高 3.14 倍37.的研究小組利用 -石含量達到 3.14%干重,青 最近,中國植物酸44.出雙氫青物中重建青由此可見, 盡管在青 以外的植途徑是可行的, 但在產物(如青竹烯合酶 cDNA 反義片段抑制青 的倍半萜支路, 通過減少 -石竹烯對紫穗槐-4,11-二烯的競爭, 使青含量提高 50%以上38.在今后的研究中, 可以考慮

19、將“開源”與“節流”兩種方法結合起來, 也許能收到更好的效果. 一種更有酸糖苷)的后處理上可能會較多的技術.3.4通過細胞培養探索青的工廠化生產長期以來,以美國堪薩斯大學 Weathers 研究團前景的創意是將青 中的非青途徑剔隊為代表, 系統地開展了青 莖尖及根系體外培養, 并通過添加植物激素45、營養成分46、光照47,48、非生物脅迫刺激劑49,50等試圖提高青 培養細胞的除或者僅保留青徑, 從而通過型代謝.途徑及其他必要的代謝途生物學創造出自然界不的新含量, 但結果均不理想. 例如, 在青 發根培青3.2通過調節激素及發育表達促進青養基中添加殼多糖能使其青含量提高 6 倍, 但青干重5

20、1,的凈產出僅為 1.8 mg/g這說明開展青素可刺激葉片生長, 而青. 因此, 提高青 中的細胞細胞青 葉片主要由素水平戊烯 素水平細胞培養并非獲取高產青的最佳選擇.有可能促進青的.春小組結果使細胞44.1關于青青生物的幾個關鍵問題基轉移酶(ipt)導入青表達具有時空特異性含量增加 30%70%39. 有關的相關性及其作用機理詳見提高 23 倍, 青植物激素與青 后述.為了闡明青高產的關系,我們利用實時熒光定量 PCR 技術追蹤分析了青的發育及組織表達模式, 結果顯示, 各生長發育(尤其是生殖發育)與青的表達水平在 8 月份開花前達到, 其中青素特異ADS mRNA 和 CYP71AV1 m

21、RNA 升幅最大, 為最低水平的 12 和 15 倍. 處于盛花期的青 在春小組擬南芥開花促進因子 1(fpf1)及(CO)分別轉化青結果發現, 雖然青 開花時間大大提前(分別提前 20 和根、莖、葉、花各個組織中都能檢測到青基14 d), 但青含量并無明顯提高, 表明開花并非因的表達, 葉片中 ADS mRNA 水平較其他組織高 22292 評 述倍左右52.mol/L 咪康唑則在 24 h 內使青倍64.含量提高 2.5我們采用組織化學染色法和分光光度法對 CYP71AV1 啟動子-GUS 融合轉化煙草在正常和脅迫條件下的表達進行定性及定量檢測,明, 在脫水、4和紫外輻射條件下, 轉結果表

22、煙草的4.3青產量與單線態氧水平高度相關GUS 活性提高 1.42.7 倍53. 瑞典及荷蘭科學家的研究結果表明, ADS, CYP71AV1, DBR2 和 ALDH1 等青在花芽及嫩葉中的表達水平比其他組織(老葉、莖、根、發根培養細胞)高 40500 倍, 而對收獲后干燥65 及重金屬均有利于青的積累, 推以往研究表明, 青(鉛)、鹽脅迫66處理青測環境脅迫尤其是氧化能與青有著十分密切的關系, 但始終缺乏活性氧參與青素生物的證據.青有負調節作用的雙氫青 醛還原酶(RED1)則只在發根培養細胞中高表達54,55.我們研究發現, 轉青 植株經過冷處理后,單線態氧的比對照植株明顯增強, 同時青4

23、.2內外環境因素促進青的與積累含量從 1.23%增加到 1.66%, 轉青 植株干粉經含量升至 2.35%67. 我們采用早在 2000 年,春小組就證明, 植物病原真15貯存后青mRNA 定量擴增技術系統地研究了低溫68、衰老69、菌可以不同程度地促進體外培養青 發根中青水楊酸及酸甲酯70等內外環境因素對青生的積累, 其中大麗花孢處理發根后的青含45%56.物的影響, 結果發現青mRNA 水平升小組也證實,含量從 7 mg/g量比對照提高南京大學高、酶類增加、青含量提高均與單線態氧大來自真菌的寡聚糖激發子可使青量同步發生, 從而為單線態氧參與調節青生物提供了直接證據.干重提高到 13 mg/

24、g 干重, 而寡聚糖激發子與一氧化氮供體硝普鈉共用, mg/g 干重57.春小組還發現,含量升高至 1222則青4.4單線態氧來自青體并可誘導青合外源性赤霉酸可以通過反成表達饋抑制赤霉酸, 將碳源分流到青途徑,擬南芥的條件性 flu 突變體在由轉光照的交替中可激發體產生單線態氧71, 并且由核導致青含量增高, 同時青 酸含量降低, 表明從的限速步驟之一58.青酸到青是青體蛋白 Executer 1 和 Executer 2 負責單組編碼的美國 Weathers 小組的研究發現, 在青 發根培養基線態氧信號從體向細胞核的逆向轉導72. 最近,中添加 2-異丙基腺嘌呤(一種細胞素), 也能顯著我們

25、還發現, Executer 1與抗氧化酶(谷胱甘肽過含量59.提高青氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉移酶)均受萜類抑Covello 小組的最新合比利時根特大學及制劑處理后激發的單線態氧的共調控(未關于內源性與外源性單線態氧在青結果).中作研究結果表明,調倍半萜酸既能腺毛發育, 也能上并大幅提高倍半萜含量60.表達,的作用, 我們利用類胡蘿卜素抑制劑證明,發現,中文大學的研究的影響取決于青酸甲酯對青體的單線態氧可作為“逆向信號轉導”誘導素的化學型, 其中型積累, 而型中青 酸和青表達73.核內編碼的青相關相反, 我較多的雙氫青 酸和青顯著減少61.們在培養基中添加單線態氧光敏發生劑孟加拉玫紅(rose

26、 Bengal)并照光或通入次氯酸鈉與過氧化氫反應中國楊酸可使青植物的研究團隊也發現, 水產生單線態氧后, 不僅顯著降低青含量, 而且導、青 酸和雙氫青 酸含量分別提高70.致大量未知產物54%, 127%和 72%62. 意大利科學家證實, 50 mmol/L以上結果表明, 單線態氧催化的非酶促反應可-環糊精或 50 mmol/L -環糊楊酸可使青 懸生物的限速步驟, 而單線態氧來源能是青浮培養細胞中的青含量達到 27 mol/g 干重, 比對照高 300 倍左右63. 他們還發現, 22 mol/L 水楊酸于細胞內而不是細胞外, 內源性單線態氧不僅能上調青變成青表達, 而且可催化雙氫青 酸

27、轉可在 30 min 內誘導青含量升高 3 倍, 而 200.22932011 年 9 月第 56 卷第 27 期5結論及展望近 10 年來, 青青基本上都由國外研究機構首先發現并鑒定, 而且幾乎所有相關均已申請國際微生物工程菌生物學進展速度驚人,體已接近工業化規模,專利保護, 我國培育青體通過微生物發酵生產青但目前還不能實現青諸多的專利壁壘. 因此, 我國不宜步國外研究將在微生物體內的.體工程菌構建的跟風研究, 而后塵開展產青國外擬采取“兩步法”策略半青: 第一用化學方應該一方面著力推動具有知識產權的高產青體, 第二在微生物中獲得青青 的田間試驗和評價, 另一方面加強青終端反應的機理研究,

28、并在此基礎上素轉體轉變成青., 必將帶來青法將青功并實現該方法一旦實施成生產方式的徹底短缺局面的根本建立青及轉青 中由雙氫青 酸高效轉變為, 也是緩解日益嚴重的青出路.青的外部條件, 爭取早日實現高產、優質、多抗等優良農藝性狀的轉青 品系的推廣應用.參考文獻 12Hsu E. The history of qing hao in themateria medica. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2006, 100: 505508Bhattarai A, Ali A S, Kachur S P,. Impact of artemisinin-based combinati

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