1、目錄第 1 章 緒 論11.1動酶免疫分析儀簡介11.2酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷程11.3動酶免分析儀國內(nèi)外現(xiàn)狀3第 2 章動酶免分析系統(tǒng)工作原理72.1 酶免分析儀基本原理72.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)72.1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分類以及測試過程82.2動酶免分析儀的組成9第 3 章動酶免分析系統(tǒng). 113.1 全波長酶標(biāo)讀板技術(shù)113.1.2 光譜分析技術(shù)113.1.2 光柵分光技術(shù)133.1.3 全波長酶標(biāo)讀板系統(tǒng)的總體方案143.2 酶免分析儀孵育與洗板技術(shù)153.2.1 孵育技術(shù)153.2.2 洗版技術(shù)153.3 加樣過程系統(tǒng). 163.3.1 液位探測技術(shù)173.3.2技術(shù)173

2、.3.3 防滴漏技術(shù)18第 4 章 總結(jié)與展望19動酶免疫分析儀第 1 章 緒論1.1動酶免疫分析儀簡介酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA/EIA，簡稱“酶免”）是一項(xiàng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)基本的、常規(guī)的檢測技術(shù)。由于免疫臨床標(biāo)志物（抗原/抗體）具有無法替代的臨床意義、以及酶免測定具有操作簡便、技術(shù)可靠的特點(diǎn)，酶免測定已經(jīng)成為傳染病血清學(xué)標(biāo)志物（如肝炎、致畸病原 Torch）、腫瘤標(biāo)志物及內(nèi)等各種臨床免疫指標(biāo)檢測的主導(dǎo)技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定

3、時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。酶免分析系統(tǒng)就是近幾十年來發(fā)展起來的基于酶聯(lián)免疫吸附測定原理的免疫指標(biāo)檢測儀器。1.2 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷程免疫學(xué)于人類對傳染性疾病的抵御能力的研究，而且研究多集中于抗體的抗能力。隨著微生物學(xué)的發(fā)展，到 20 世紀(jì)中期以后，各種抗原、抗體的作用進(jìn)行深入

4、研究，免疫學(xué)分析進(jìn)行了細(xì)化，發(fā)展了基礎(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)、免疫學(xué)檢測和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)等多個分支。依據(jù)不同類型的抗原-抗體反應(yīng)又建立了各種免疫分析技術(shù)，根據(jù)在反應(yīng)中是否引入標(biāo)記物免疫分析術(shù)又分為非標(biāo)記免疫分析和標(biāo)記免疫分析兩大類。非標(biāo)記免疫分析是利用抗原-抗體反應(yīng)后生成復(fù)合物進(jìn)行檢測的方法，具有高度的特異性，但是著靈敏度不高，缺乏可供測量的信號的缺點(diǎn)，因此人們采用了各種標(biāo)記技技術(shù)來對抗原抗體的反應(yīng)進(jìn)行檢測，通過檢測標(biāo)記物來反應(yīng)抗原和抗體的結(jié)合情況，從而檢測地測量出被檢抗原或抗體的和含量。常用的標(biāo)記物有熒光素、酶、放射性核素及膠體金等，免疫標(biāo)記技術(shù)根據(jù)標(biāo)記物種類的研究分支如下圖 1.1 所示：1圖 1

5、.1 免疫標(biāo)記技術(shù)的研究分支酶是一種能催化化學(xué)反應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)，其催化效力超過目前所有的人造催化劑，一般可使反應(yīng)1081010 倍。此外，酶還具有高度的專一性，即每一種酶只催化一種或一組密切相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)，酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）就是使用酶為標(biāo)記物的免疫分析術(shù)，是應(yīng)用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體特異性反應(yīng)，從而提高免疫學(xué)的敏感性，瑞典學(xué)者 Engvall 和 Perlmann，荷蘭學(xué)者 Van Weeman 和 Schuurs 分別，將檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法稱為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），并已地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、病及非傳染病等方面的免疫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，

6、ELISA 法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定以及易于自動化等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本，也適用于血清流行病學(xué)。免疫吸附試驗(yàn)不僅可以用來測定抗體，而且可以用于測定體液中的循環(huán)抗原，是一種早期的良好方法。早期 ELISA 檢驗(yàn)操作多采用手工加樣本和試劑，對反應(yīng)完成的有色物質(zhì)溶液顏色深度進(jìn)行目視比色或者光電比色。20 世紀(jì) 90 年代初期，開啟了以為代表的“全面自動化”（TLA）運(yùn)動，手工酶免試驗(yàn)操作成為了 TLA 的主要。ELISA 試劑盒商業(yè)化的啟動，抗原和抗體能緊密結(jié)合于固體物質(zhì)的固相技術(shù)應(yīng)用于微滴定板，技術(shù)上的優(yōu)勢導(dǎo)致了自動加樣設(shè)備、多通道加樣器

7、和自動洗板機(jī)、讀板機(jī)/酶標(biāo)儀的發(fā)明，半自動以及動的酶免疫分析技術(shù)取代了手工操作。90 年代末期，ELISA 檢測系統(tǒng)的靈敏度和特異性以及檢測過程的自動化得到了顯著提高與完善，酶免試驗(yàn)成為了傳染病血清學(xué)標(biāo)志物（如肝炎、致畸病原）、腫瘤標(biāo)志物及內(nèi)等各種臨床免疫指標(biāo)檢測的主導(dǎo)技術(shù)。酶免試驗(yàn)全過程化的意義，并非僅僅限于降低勞動強(qiáng)度、減少人為的誤差。根據(jù)已的（FAME）評價，人們發(fā)現(xiàn)：動酶標(biāo)分析系統(tǒng)可以普遍地、顯著地提高酶免試驗(yàn)的特異性，如系統(tǒng)可以提高提高到 97.4%。表抗的特異性由常規(guī)設(shè)備的 87%到 91%，丙肝抗體由常規(guī)設(shè)備的 89.1%2雙位一點(diǎn)法電化學(xué)免疫技術(shù)間接法化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)雙抗原夾心

8、法免疫標(biāo)記技術(shù)免疫熒光技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)競爭法酶標(biāo)技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法放射物標(biāo)記技術(shù)1.3動酶免分析儀國內(nèi)外現(xiàn)狀早期的酶免測試系統(tǒng)需要人工使用注射器對酶標(biāo)板進(jìn)行血清學(xué)標(biāo)志物樣品加樣，再送入恒溫水槽進(jìn)行預(yù)溫。然后使用加樣器加入酶反應(yīng)試劑孵育，待充分反應(yīng)后通過人工對酶標(biāo)實(shí)驗(yàn)板進(jìn)行。后的酶標(biāo)實(shí)驗(yàn)板由分光光度計(jì)進(jìn)行免疫指標(biāo)分析。上世紀(jì) 90 年代末，以為代表的發(fā)達(dá)提出了“全面自動化”（TLA）運(yùn)動，這對于在 90 年代初期發(fā)展起來的手工酶免實(shí)驗(yàn)測試系統(tǒng)已成為了 TLA 的主要。由于全面自動化具有標(biāo)準(zhǔn)化、高效率、高質(zhì)量的自動化與化特征，正成為臨床發(fā)展的新趨勢。因此，研究酶免疫自動測試系統(tǒng)具有

9、重要的科學(xué)意義和巨大的市場需求。國外對動酶免測試系統(tǒng)的研究，可以回溯到上個世紀(jì) 90 年代末期。第一自動酶免分析系統(tǒng)是由哈美頓（HAMILTON）公司生產(chǎn)的，由于單針加標(biāo)本每板需要 15 分鐘，三塊板共需 45 分鐘完成加標(biāo)本工作，系統(tǒng)加標(biāo)本占用了較長時間。因此，第一自動酶免分析系統(tǒng)，被認(rèn)為是“節(jié)約勞動力而不能提高效率”的自動酶免分析系統(tǒng)，第一臺該類型設(shè)備由哈美頓（HAMILTON）公司生產(chǎn)并于 2002 年上市，哈美頓第一自動酶免分析系統(tǒng)實(shí)物圖如圖 1.2 所示。第二自動酶免分析系統(tǒng)被認(rèn)為是不含標(biāo)本加樣裝置動酶免分析系統(tǒng)，通常也稱“后處理系統(tǒng)”，其基本技術(shù)特征為非常任務(wù)和單一軌道。第三代動酶

10、免分析系統(tǒng)的基本特征是采用多任務(wù)、多通道，完全實(shí)現(xiàn)平行過程處理，典型為哈美頓公司的 FAME()動酶免分析系統(tǒng)。系統(tǒng)是世界公認(rèn)的處理速度最快的動酶免分析儀，它可以同時處理 25 個不同的分析項(xiàng)目，并且采用完全開放的系統(tǒng)模式，可同時運(yùn)行 10 個不同廠商的系統(tǒng)試劑從而方便用戶選擇使用多家試劑，優(yōu)化組合，F(xiàn)AME動酶免分析系統(tǒng)如圖 1.3 所示。圖1.2 第一自動酶免分析系統(tǒng)圖1.3 第三自動酶免分析系統(tǒng) FAME當(dāng)前，在醫(yī)療器械領(lǐng)域已經(jīng)形成了以發(fā)達(dá)為主導(dǎo)的格局。Addcare（）、TRITURUS（變色龍）、Tencan（帝肯）、Beckman Coulter（）、URANUS（尤瑞）等公司都在

11、整機(jī)設(shè)備的模塊研發(fā)、流程安排等方面進(jìn)行了大量的研究，進(jìn)一步提高了測試速度及精度。其中在測試速度方面比較有代表性的是公司的流水線式動酶聯(lián)免疫工作站2200系列。該工作站使用比較有一臺前處理器與兩器結(jié)合，分別進(jìn)行加樣本、加試劑操作，避免多次加液都占用前處理器，提高了效率。測試速度最高可達(dá)32200TESTS/H，8個通道在96微孔板中加入100L樣品（包括更換新的吸頭）所需的時間為280s，在96微孔板中連續(xù)分配試劑所需時間為40s。免疫工作站2200系列如圖1.4所示。公司的流水線式動酶聯(lián)圖1.4公司流水線式動酶聯(lián)免疫工作站2200各公司在努力研發(fā)知識產(chǎn)權(quán)的同時也通過引進(jìn)其他公司先進(jìn)的子模塊進(jìn)行

12、自主設(shè)計(jì)，比如URANUS（）公司的動酶免疫200系列主要模塊均由國口：XIRIL公司原裝動加樣器、TencanSUNRISE酶標(biāo)儀以及帶有16針洗板頭的洗板機(jī)。該系統(tǒng)采用全新的“雙艙雙機(jī)械臂”設(shè)計(jì)理念，通過前后艙的設(shè)置合理安排實(shí)驗(yàn)步驟和實(shí)驗(yàn)時間，最終實(shí)現(xiàn)真正意義上的循環(huán)。URANUS動酶免疫200如圖1.5所示。圖1.5URANUS動酶免疫200除了硬件及原理方面的研究，在操作界面及軟件管理方面也是各公司爭相研究的領(lǐng)域。比如，變色龍公司的開放式動酶免系統(tǒng)采用國際標(biāo)準(zhǔn)ASTM聯(lián)網(wǎng)格式，系統(tǒng)能以文件或國際標(biāo)準(zhǔn)ASTM通訊方式與電腦中心進(jìn)行單、雙向數(shù)據(jù)通訊，為用戶實(shí)現(xiàn)內(nèi)部計(jì)算機(jī)管理提供方便連接。變

13、色龍開放式動酶免系統(tǒng)如圖1.6所示。4圖1.6變色龍開放式動酶免系統(tǒng)隨著技術(shù)的進(jìn)步、勞動強(qiáng)度的增大和對安全性越來越多的關(guān)注，滿足現(xiàn)代GMP/GLP 要求的標(biāo)準(zhǔn)化、高效率、高質(zhì)量的動酶免分析系統(tǒng)，正在世界各種實(shí)驗(yàn)室里形成了巨大的需求。然而，國內(nèi)的動酶免分析儀的發(fā)展不容樂觀。國內(nèi)的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)近年起步，由于受到技術(shù)的限制，目前國內(nèi)只是在某個過程或功能上實(shí)現(xiàn)自動化處理，即分離式酶聯(lián)免疫儀器。與酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)相關(guān)的多為小型酶標(biāo)儀、洗板機(jī)等，自 ELISA 試驗(yàn)技術(shù)于 20 世紀(jì) 80 年代引入中國，與之相關(guān)的分析儀器也得到了快速發(fā)展，我國先后出現(xiàn)了十余家酶標(biāo)儀、洗板機(jī)生產(chǎn)廠商，在上與眾多的進(jìn)口酶

14、標(biāo)儀器進(jìn)行競爭。目前國內(nèi)主要生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)不具備整體工作條件，只是在某個過程或功能上可以實(shí)現(xiàn)自動處理，因而還屬于半自動的小型酶標(biāo)洗板儀，如北京新技術(shù)的 DNM9602A 型酶標(biāo)分析儀、匯松科技 PW-960 96 針高效動酶標(biāo)洗板機(jī)，都是只具有酶免分析檢測功能和洗板功能的組合。DNM9602A 型酶標(biāo)分析儀如圖 1.7 所示。PW-960 96 針高效動酶標(biāo)洗板機(jī)如圖 1.8 所示。圖1.7北京DNM9602A型酶標(biāo)分析儀圖1.8匯松科技PW-96096針高效動酶標(biāo)洗板機(jī)5同時，國內(nèi)某些生產(chǎn)子模塊的公司也引入國外先進(jìn)的動加樣器等模塊搭建出某種意義上的整機(jī)。比如，安圖公司引入Sisa公司

15、的Lisa動加樣器并添加相應(yīng)的輔助設(shè)備（酶標(biāo)檢測儀、發(fā)光檢測儀、洗板機(jī)等）搭建出整機(jī)測試環(huán)境。安圖公司的A2000系列動酶免分析儀如圖1.9所示。圖1.9國產(chǎn)安圖A2000系列動酶免分析儀愛康電子引入 Xantus（斯）動加樣器并結(jié)合研發(fā)的 Poseidon AK03B血型分析儀搭建整機(jī)環(huán)境。愛康公司的動血型分析儀如圖 1.10 所示。圖1.10愛康動血型分析儀由于國內(nèi)醫(yī)療條件發(fā)展不平衡，國產(chǎn)半自動小型酶標(biāo)洗板儀性能不穩(wěn)定，引進(jìn)國外先進(jìn)的動酶免分析系統(tǒng)又需要大量的資金，因而，目前國內(nèi)相當(dāng)多的醫(yī)院及醫(yī)療機(jī)構(gòu)還通過手工來完成酶聯(lián)免疫試驗(yàn)的現(xiàn)象。在沒有酶標(biāo)儀的情況下，需要人工使用注射器對樣品進(jìn)行加樣

16、，充分反應(yīng)后再人工送到酶免檢測儀中進(jìn)行分析。甚至酶標(biāo)實(shí)驗(yàn)板的工作也要通過人工來完成，這些都會給試驗(yàn)結(jié)果帶來很大的實(shí)驗(yàn)誤差，同時也降低了試驗(yàn)質(zhì)量。國內(nèi)各級別的醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)還大量的酶免試驗(yàn)是通過手工完成的現(xiàn)象，不能夠保證加樣量的準(zhǔn)確性。在沒有動化酶標(biāo)儀的情況下，通常需要人加樣器對樣品進(jìn)行加樣，充分反應(yīng)后再人工送到酶免檢測儀（如酶標(biāo)儀等）中進(jìn)行分析。這樣會給酶免試驗(yàn)結(jié)果帶來很大的誤差，造成誤判，在執(zhí)行低效的操作的同時也降低了試驗(yàn)質(zhì)量。因此，在國內(nèi)研究開發(fā)動酶免分析系統(tǒng)迫在眉睫，將半自動小型酶標(biāo)洗板儀發(fā)展成為動酶免分析系統(tǒng)是我國酶免分析技術(shù)發(fā)展的迫切需要。6第 2 章動酶免分析系統(tǒng)工作原理2.1 酶免分

17、析儀基本原理動酶免分析系統(tǒng)是基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)工作過程設(shè)計(jì)的，是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)過程的自動化，現(xiàn)已應(yīng)用在醫(yī)學(xué)檢測、動物檢疫檢測、植物檢測、食品安全檢測等領(lǐng)域，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，檢測過程自動化能夠提高酶免分析實(shí)驗(yàn)的特異性，提高檢檢測效率，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一般包括雙抗體夾心法、抗原競爭法、間接法等基本檢測方法，下面將對酶免分析實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附分析全稱為光度酶聯(lián)免疫分析，也稱被簡稱為 ELISA，最早由 Engvall 和Perlmann 與 Van Weeman 和 Schurs 同時建立的，并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。ELISA 通過利用抗原、抗體復(fù)合物同酶

18、標(biāo)記物的免疫特異性反應(yīng)和酶的催化放大作用相結(jié)合，既能保持酶催化反應(yīng)的敏感性又能保持抗原抗體反應(yīng)的特異性，而且能夠極大地提高靈敏度。目前，被主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、動物檢疫檢驗(yàn)、植物檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)等，已經(jīng)成為抗原抗體檢測的強(qiáng)的。它的基本原理是：1. 使抗體或抗原能結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；2. 抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的催化活性。3.在測定時，使受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)，最后結(jié)合在固相載體上的酶的含量與標(biāo)

19、本中受檢物質(zhì)的量成一定比例關(guān)系。4.加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，因此可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性分析或定量分析受檢物質(zhì)的含量。由于酶的催化效率很高，一酶在 1min 內(nèi)可催化數(shù)十萬乃至上千萬底物變?yōu)轱@色產(chǎn)物，故可高效地放大反應(yīng)信號，使測定方法有很高的靈敏度。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)原理可知，整個 ELISA 實(shí)驗(yàn)可以分為三個部分：免疫學(xué)反應(yīng)過程，包括抗原、抗體、酶和標(biāo)記物之間的反應(yīng)；酶和底物催化反應(yīng)過程，可以使用不同的酶/底；檢測方法的建立，可以利用產(chǎn)物的理化性質(zhì)，可以采用化學(xué)發(fā)光分析法、分光光度法、電化學(xué)分析法、熒光分析法等分析對酶催化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。

20、72.1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分類以及測試過程ELISA檢驗(yàn)技術(shù)日趨成熟并得到廣泛應(yīng)用，在檢測過程中有三種必要試劑：1、固相的抗原或抗體；2、酶標(biāo)記的抗原或抗體；3、酶反應(yīng)底物。酶聯(lián)免疫分析實(shí)驗(yàn)既可以用于檢測抗原又可以用于檢測抗體，人們在早期的雙抗體夾心法的基礎(chǔ)上，建立和改進(jìn)許多方法，并成功用于的檢測與鑒定。根據(jù)試劑性質(zhì)和標(biāo)本的形狀以及檢測的具體條件，設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法，ELISA常用檢測方法如下：1) 雙抗體夾心法特性抗體固相，檢測帶有抗原的樣本，檢測方法的基本原理如圖2.1所示：圖 2.1 雙抗體夾心法原理示意檢測過程：1、 特異性抗體包被到固相載體上，洗滌去沒有吸附的抗體。2、

21、載體中加入含有待測抗原的樣品，先經(jīng)過孵育，使抗原和包被的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，然后洗滌，把沒有反應(yīng)的抗原掉。3、 加入使用酶標(biāo)記的特異性抗體與結(jié)合在固相載體上的抗原反應(yīng)，經(jīng)過孵育、洗滌，把多余未結(jié)合酶標(biāo)抗體洗去。4、 最后加入底物溶液，被經(jīng)過酶催化反應(yīng)，產(chǎn)生可顯色的底物，用于檢測。這種檢測方法具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是欲檢測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，一端要與包被在固相載體上的抗體作用，另一端要與特異性酶標(biāo)記的抗體作用。所以，不能用于檢測量小于 5000 的半抗原類的抗原檢測。此方法可以用在霍亂腸毒素的測定，HbSAg 及 HbS 的測定。2)競爭法既可以用于檢測抗原也可以

22、用于檢測抗體。以檢測抗原為例，其示基本原理如圖 2.2所示檢測過程：8圖 2.2 抗原檢測競爭法示意圖1、載體中加入特異性抗體，包被形成固相抗體，洗滌掉多余的抗體。2、 包被完成后的固相載體分為兩組，一組為待測載體，另一組為參考載體。在待測載體中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，兩者競爭與固相抗體結(jié)合。在參考載體中只加入酶標(biāo)抗原，經(jīng)過孵育后，分別洗滌掉沒有結(jié)分。3、 加入底物試劑經(jīng)過酶催化顯色。參考載體中由于固定的酶標(biāo)抗原量最多，故顏色最深。參考載體顏色深度與待測載體顏色深度之差，與受檢標(biāo)本中的抗原含量有直接關(guān)系。待測載體顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原量越多。這種方法所測定的抗原只要有一個結(jié)合部

23、位即可，因此，對小抗原如激素和之類的測定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快，因?yàn)橹挥幸粋€保溫洗滌過程。需用較多量的酶標(biāo)記抗原為其缺點(diǎn)。2.2動酶免分析儀的組成動酶免分析系統(tǒng)采用模塊化結(jié)構(gòu)，其中各個子模塊都有相應(yīng)的分立，常用的酶標(biāo)孵育模塊、洗板模塊和讀板模塊整合到一起，動加樣器用來進(jìn)行前處理過程中液體的吸取及分配，另外對于洗板過程還有的洗板機(jī)。各個子模塊的設(shè)計(jì)及實(shí)現(xiàn)均是動酶免分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)過程中的關(guān)鍵點(diǎn)，每一部分的性能狀況都會影響到最終測試結(jié)果的精密度。按照酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）反應(yīng)過程將酶免試驗(yàn)過程中的加樣、洗板、孵育、讀板等過程劃分為酶免分析儀的不同模塊，儀器的原理框圖如圖2.3所示。9移液通道

24、中央控制單元洗板模塊孵育模塊微量移液平臺讀板模塊固相器皿傳送單元圖2.3酶免分析儀的原理框圖ELISA 的檢測方法有很多，但是不論選擇哪種方法，ELISA 都包括 6 個步驟：1、抗原抗體吸附于固相；2、加標(biāo)本和試劑；3、孵育和洗板；4、加酶標(biāo)抗原和抗體；5、加適當(dāng)?shù)牡孜铮?、檢測和分析結(jié)果。從 ELISA 的檢驗(yàn)步驟可以看出，ELISA 一般需要進(jìn)行 45 次加樣，加樣等待的時間的差異會導(dǎo)致樣本位之間的酶標(biāo)試劑與血清樣本反應(yīng)時間以及孵育時間的不均勻，這樣會使反應(yīng)完成后的酶標(biāo)儀讀數(shù)結(jié)果誤判率增大，可見加樣過程對于酶免分析過程的重要性。ELISA 在臨普遍應(yīng)用于傳染毒血清標(biāo)志物的定性檢測，由于標(biāo)

25、本中待測物質(zhì)的變化范圍大，對測定過程中標(biāo)本分配針的洗滌要求高，否則會造成攜帶污染。另外，在重復(fù)使用加樣針時，干燥的加樣針上少量的蒸餾水（或鹽水）會造成稀釋效應(yīng)，使部分低值弱陽性標(biāo)本漏檢。國內(nèi)外有一些生物學(xué)實(shí)驗(yàn)攜帶污染的，并提出一些解決方案。ELISA 實(shí)驗(yàn)的攜帶污染通常是指加樣針（或吸頭）在分配陽性標(biāo)本后，洗滌或洗滌次數(shù)不夠造成對其后標(biāo)本檢測結(jié)果的影響。在 ELISA 實(shí)驗(yàn)中主要表現(xiàn)在強(qiáng)陽性標(biāo)本對陰性標(biāo)本的污染，使標(biāo)本誤檢為（弱）陽性。另一種形式的攜帶污染就是攜帶污染，即稀釋效應(yīng)的。在重復(fù)使用加樣針的系統(tǒng)中，洗滌后干燥的加樣針中的微量的殘留液（不同的儀器加樣系統(tǒng)不同，其殘留液的量也不一致），在

26、分配下一份標(biāo)本時，可能造成稀釋，如果該標(biāo)本為 CutOff 值附近的弱陽性標(biāo)本，則可能造成漏檢。減少加樣過程中攜帶污染，是對加樣過程的重要技術(shù)要求，對于檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有直接影響。10PC三維運(yùn)動系統(tǒng)三維運(yùn)動系統(tǒng)第 3 章動酶免分析系統(tǒng)動酶免分析系統(tǒng)包含子模塊眾多并且檢驗(yàn)流程復(fù)雜，每個環(huán)節(jié)都必須達(dá)到一定要求才能夠保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。動酶免分析系統(tǒng)中主要包括以下幾個方面：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，由于光源的光譜范圍限制和單色器的類型及質(zhì)量因素的影響，或者濾光片狹縫寬度調(diào)節(jié)不當(dāng)，使酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分光光度法測試的準(zhǔn)確性受到限制。（2）讀板結(jié)果準(zhǔn)確性的保證。讀板模塊是檢驗(yàn)過程的最后一

27、個環(huán)節(jié)，讀板結(jié)果的質(zhì)量將直接影響到整個檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對讀板模塊的設(shè)計(jì)既要保證讀板的時間，又要保證其分辨率、線性、精度、重復(fù)性均在誤差的范圍內(nèi)。（3）洗板殘余量的技術(shù)。在整個檢驗(yàn)過程中需要進(jìn)行多次加樣及洗版操作，洗版殘余量會直接影響到后續(xù)反應(yīng)及檢驗(yàn)結(jié)果，對于洗版模塊的設(shè)計(jì)需要做到保證洗板速度的前提下確余量不超過 1L。（4）液位精確探測技術(shù)。作為樣本檢測的第一步，必須進(jìn)行樣本和試劑的吸液，為了確定吸樣針進(jìn)入液面的深度，要能夠準(zhǔn)確無誤的探測到液面。對液位探測模塊的設(shè)計(jì)要求是準(zhǔn)確、無干擾的分別探測液面，并且盡量減少攜帶污染。（5）多任務(wù)間的時序安排。系統(tǒng)具有多任務(wù)平行處理的能力，運(yùn)送單元需要將待

28、檢物分別運(yùn)到各個單元進(jìn)行相應(yīng)的，安排其行程從而做到準(zhǔn)確、高效。（6）加樣過程技術(shù)。加樣過程設(shè)計(jì)吸/分液過程以及加樣尖隨加樣臂運(yùn)動過程，由于臨床各種檢驗(yàn)項(xiàng)目中所需要吸取的試劑不同，吸液過程中可能會由于樣本量不足、凝塊、氣泡等異常現(xiàn)象，影響吸液量的準(zhǔn)確性。移液過程中可能會有液體滴漏現(xiàn)象，分液過程中也可能會有堵針、氣泡等異常現(xiàn)象影響分液量的準(zhǔn)確性，從而造成參與反應(yīng)的樣本量出現(xiàn)異常。對加樣過程模塊的設(shè)計(jì)需要能夠?qū)訕舆^程進(jìn)行實(shí)時，并且對加樣過程中的異常現(xiàn)象進(jìn)行。3.1 全波長酶標(biāo)讀板系統(tǒng)設(shè)計(jì)3.1.2 光譜分析技術(shù)一. 分光光度法物質(zhì)對照射到其表面的光有吸收作用，其光吸收特征具有特異性，吸收光譜法就是

29、以此為基礎(chǔ)，通過測量這種光吸收作用來分析物質(zhì)的特性或含量。將特定波長的光透射通過一定濃度的樣品溶液可得到對應(yīng)的光強(qiáng)吸收度，分別以濃度和光強(qiáng)吸收度作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，就可以得到該溶液中樣品物質(zhì)的特征光譜曲線，繼而利用該光譜曲線對待測樣品進(jìn)行定性或11定量的分析檢測稱為分光光度法。分光光度法是比色法的發(fā)展，根據(jù)光譜范圍不同，又可分為這幾種：1. 紫外光分光光度法，主要用于檢測對紫外光有吸收的無色物質(zhì)溶液；2. 可見光分光光度法，主要用于檢測有色物質(zhì)溶液；3. 紅外光分光光度法，主要用于檢測對紅外光有特征吸收的無色物質(zhì)。其中，紫外光和可見光分光光度法在 ELISA 實(shí)驗(yàn)中使用最分光光度法，紅外光分光

30、光度法使用到的較少。，一般合稱為紫外-可見二.-定律當(dāng)入射光透射通過待測溶液時，吸光度與三種主要因素有關(guān)：溶液的濃度、液層的厚度和入射光的波長。反映這種關(guān)系的定律有 2 個：定律(Lambert Law)：當(dāng)入射光的波長已確定時，影響光強(qiáng)吸收度的就只有溶液1.的濃度和液層的厚度；定律(Beer Law)：當(dāng)入射光的波長和溶液的濃度不變，且測量環(huán)境濃度一定時，2.光強(qiáng)吸收度就只和液層的厚度成正比。在實(shí)際測量中，溶液濃度及液層厚度是需要同時考慮的影響因素，這兩個定律被合稱為定律(Lambert-Beer Law) 。分光光度法和比色法都是利用定律-：(Lambert-Beer Law)為基本原理來

31、檢測物質(zhì)的特性與濃度含量。其數(shù)學(xué)表A = lgT = lg I = lg I0 = lg 1 = kLc(3.1)I0IT上式中，A 為吸光度值，T 為光強(qiáng)透過率，I0 為入射光強(qiáng)度，I 為透射光強(qiáng)度，k 為特定吸光系數(shù)，L 為液層厚度(cm), c 為溶液的濃度(mol)，光路原理如圖波長下物質(zhì)的ml3.1 所示。需要注意的是，在實(shí)際應(yīng)用中，只有測量環(huán)境滿足一定條件時，能成立，其適用條件如下：-定律才1入射光應(yīng)為窄帶單色光，因?yàn)閱紊鈳挻髣t純度低，造成的系統(tǒng)誤差大；2待測溶液濃度有一定上限，當(dāng)溶液濃度變大而渾濁時，鄰近的會造成間的相互干擾作用，吸光度加合性質(zhì)被破壞，該定律不再成立；3. 僅

32、適用于于吸收光譜分析，在發(fā)射和散射光譜分析中沒有成立條件。圖 3.1-定律123.1.2 光柵分光技術(shù)全波長酶標(biāo)讀板系統(tǒng)的色散元件采用光柵來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的濾光片或棱鏡。光柵是一塊表面刻上大量密集的平行、等寬、等距、不透明刻線的石英或光滑金屬片，利用刻槽的衍射效應(yīng)對復(fù)合光進(jìn)行色散，衍射原理如圖 3.2 所示。光柵法線入射光衍射光刻線間距圖 3.2 光柵的衍射光柵有兩種制作方法：一種是用光柵刻劃機(jī)在或金屬表面上刻出溝槽的經(jīng)典方法；另一種是利激光條紋在特定材質(zhì)表面上顯影成像的全息方法。刻劃機(jī)制作的光柵難以保證刻線的平行性、等間距和等深度，因而會產(chǎn)生鬼線(Ghost Line)的干擾，鬼線是光譜線(母線)

33、旁側(cè)出現(xiàn)的假線，光學(xué)技術(shù)制作的全息光柵可以避免鬼線的產(chǎn)生。以光柵為色散元件的可控分光模塊又稱光柵單色器，其主要部件包括了色散元件、準(zhǔn)直鏡、聚光鏡和入、出射狹縫，功能是將入射的復(fù)合光分解為波長可調(diào)的單色光。根據(jù)光柵型號、光路構(gòu)造的不同可分為多種類型：1. Fastie-Ebert(FE)型單色器，以一塊大面積球面反射鏡和一塊衍射光柵為，屬于一種常見的造價低廉的設(shè)計(jì)，但是由于球面偏差(Spherical Aberration)、彗差(Coma)和散光偏差(Astigmatism)等難以消除的系統(tǒng)誤差，成像能力一般；2. Czerny-Turner(CZ)型單色器，以兩塊凹面反射鏡和一塊平面衍射光柵

34、為，根據(jù)具體需求可以改變反射鏡的，由于光路結(jié)構(gòu)采用了非對稱幾何學(xué)，對彗差有較好的效果，但依然球面偏差和散光偏差的干擾；3. 平面場(Flat Field)型單色器，以一塊平面場型衍射光柵為，克服了 FE 型和 CZ 型單色器光譜聚焦在圓面上導(dǎo)致的像差問題，其面為平面，通常配合陣列探測器來使用；4. 凹面消像差(Concave Aberration Elimination)型單色器，以一塊凹面消像差型衍射光柵，由于僅采用了一個光學(xué)元件，沒有其它輔助光路，這類單色器成本低且體積小，能為夠在連續(xù)光譜范圍內(nèi)最大程度地降低系統(tǒng)誤差的影響。133.1.3 全波長酶標(biāo)讀板系統(tǒng)的總體方案全波長酶標(biāo)讀板系統(tǒng)相比

35、于傳統(tǒng)讀板系統(tǒng)的構(gòu)造基礎(chǔ)上，在單色器模塊有較大改進(jìn)，采用了光柵分光技術(shù)，以凹面光柵為色散元件，總體方案如圖 3.3 所示。鹵鎢燈光源發(fā)出的白光，經(jīng)光柵單色器濾光成為單色光，再經(jīng)光纖傳輸和透鏡匯聚后，透射通過微孔板中的待測溶液，透射光被聚光鏡匯聚到光電二極管的探測窗口上，光強(qiáng)信號被線性轉(zhuǎn)化為電流信號。信號處理部分負(fù)責(zé)對電流信號進(jìn)行處理，經(jīng)過電流-電壓轉(zhuǎn)化、信號放大和 AD 轉(zhuǎn)換后的數(shù)字信號被 FPGA 接收。FPGA 主控部分負(fù)責(zé)與 CPU 通信，根據(jù) CPU的、微孔板進(jìn)出驅(qū)動和數(shù)據(jù)處理等，并將處理結(jié)果傳送到 CPU。令實(shí)現(xiàn)光柵單色器圖 3.3 讀板系統(tǒng)總體方案全波長酶標(biāo)讀板系統(tǒng)的光路設(shè)計(jì)如圖3

36、.4 所示，經(jīng)凹面光柵分出的單色光被狹縫調(diào)節(jié)后，自下而上地透射通過待測溶液。光電二極管聚光鏡凹面光柵光闌酶標(biāo)孔狹縫光纖狹縫白光光源圖 3.4 讀板系統(tǒng)光路圖采用自下而上地透射待測溶液的檢測光路，以適應(yīng)酶標(biāo)孔的形狀，如圖 3.5 所示。顯然，自下而上的檢測光路具有更高的透射光檢測效率。14CPU鹵鎢燈信號處理FPGA光柵單色器光電二極管聚光鏡光闌微孔板光 纖光電二極管光束光電二極管光束圖 3.5 兩種檢測光路對比圖3.2 酶免分析儀孵育與洗板系統(tǒng)設(shè)計(jì)3.2.1 孵育系統(tǒng)的設(shè)計(jì)孵育系統(tǒng)模擬的溫度環(huán)境，保證需要檢測的體液樣本和試劑在一定的時間內(nèi)能充分有效的反應(yīng)。如果溫度的調(diào)節(jié)時間過長，會降低整個系統(tǒng)

37、的效率。相反，則容易出現(xiàn)超調(diào)現(xiàn)象，導(dǎo)致反應(yīng)酶降低甚至喪失其活性，從而進(jìn)一步導(dǎo)致后續(xù)檢測結(jié)果的確性。溫度的好壞直接影響著動酶免分析儀的檢測結(jié)果的正確性和準(zhǔn)確性。動酶免分析儀孵育模塊要求溫度精度為±0.5，溫度范圍為室溫到55，步進(jìn)1，上位機(jī)能夠設(shè)定所需要的溫度，并且能夠?qū)崟r的顯示當(dāng)前的溫度。根據(jù)要求設(shè)計(jì)了如圖 3.6的孵育系統(tǒng)，PC 機(jī)通過 USB 和主控模塊通信，主控模塊和孵育模塊等其他子模塊通過 CAN總線通信。溫度的部分位于孵育模塊溫控 DSP 中，它對通過溫度傳感器對溫度數(shù)據(jù)進(jìn)行，并通過內(nèi)部程序中的算法產(chǎn)生 PWM 波，經(jīng)后續(xù)電路放大后給加熱板加熱，使孵育板上的溫度達(dá)到所設(shè)定的

38、溫度。圖 3.6 孵育系統(tǒng)系統(tǒng)框圖3.2.2 洗版系統(tǒng)的設(shè)計(jì)洗板操作是 ELISA 實(shí)驗(yàn)中不可或缺的重要操作步驟。經(jīng)過反應(yīng)的試劑和樣品需要經(jīng)過15嚴(yán)格的洗板過程，除去微板當(dāng)中反應(yīng)過剩的物質(zhì)和干擾物，然后再經(jīng)過后續(xù)的檢測，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。ELISA 實(shí)驗(yàn)要求有一個穩(wěn)定有效的洗板過程，沒有完成洗板則無法進(jìn)行下一步的操作；洗板不穩(wěn)定必將造成試驗(yàn)結(jié)果的波動甚至失敗。根據(jù)動酶免分析儀洗板系統(tǒng)的要求，設(shè)計(jì)了洗板系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。自動酶免分析儀洗板系統(tǒng)主要由系統(tǒng)、液路氣路系統(tǒng)、機(jī)械傳動系統(tǒng)、通四部分組成。其中通主要是 PC 機(jī)和洗板系統(tǒng)通過 USB 線進(jìn)行連接，保證洗板系統(tǒng)既能夠滿足動酶免分析儀自動化的要

39、求，也能單獨(dú)進(jìn)行洗板系統(tǒng)操作。其中 USB 通信采用第二講述的通的通信方式。其中，機(jī)械傳動系統(tǒng)由水平和垂直兩個運(yùn)構(gòu)組成，水平運(yùn)構(gòu)實(shí)現(xiàn)微板的水平移動而垂直運(yùn)構(gòu)實(shí)現(xiàn)頭的上下運(yùn)動；液路氣路系統(tǒng)由電磁泵、真空泵、電磁閥、洗液瓶、廢液瓶、頭等組成。洗板系統(tǒng)模塊主要完成的功能如下：1）完結(jié)合機(jī)械結(jié)構(gòu)完成對洗板系統(tǒng)位成協(xié)議的命令和數(shù)據(jù)的傳輸 2）通過對步進(jìn)電機(jī)的置的精確和震蕩動作的穩(wěn)定。3）通過對氣路和液路系統(tǒng)的保證洗滌和吸液徹底，避免針頭堵塞。儀器工作時頭上下運(yùn)動，氣路液路相配合，實(shí)現(xiàn)對微板的吸液與噴液；水平載物臺上的微板每一排沖洗完成后, 微板水平移動，準(zhǔn)確移動至下一排的位置。系統(tǒng)框圖如圖 3.7 所示

40、。圖 3.7 洗板機(jī)系統(tǒng)框圖3.3 加樣過程系統(tǒng)加樣系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)吸液、分液、傳送微孔板等任務(wù)。有四個的加樣通道，各個通道板均具有各自的 Y 軸電機(jī)、Z 軸電機(jī)、分液（Dosing）電機(jī)、擠壓（Squeeze）電機(jī)。Y 軸和 Z 軸電機(jī)負(fù)責(zé)加樣槍的 Y 向和 Z 向的位置移動；分液電機(jī)負(fù)責(zé)加樣槍活塞的上下運(yùn)動，來完成吸液和分液；擠壓電機(jī)負(fù)責(zé)擠壓 O 型圈來抓取 Tip 頭或微板抓手，完成取針和棄針動作。加樣過程包括提取 Tip 頭（加樣尖）、液位探測、吸取樣本、分配樣本四個過程。在整個過程中所涉及到的主要有：吸/分液過程中加樣尖對液位的精確探測、加樣過程16中及對加樣異常及時判定并、移液過程防滴漏的

41、實(shí)現(xiàn)。按照吸取樣本的導(dǎo)電性不同，液位探測可以選擇電容法液位探測（導(dǎo)電液體）和法液位探測（不導(dǎo)電液體）。吸取樣本及分配樣本過程中，對加樣槍內(nèi)氣壓進(jìn)行并和正常加樣過程中監(jiān)控曲線進(jìn)行對比，可以選擇幅值及斜率作為比較參數(shù)對漏氣、樣本量不足、凝塊堵針、樣本中有氣泡等異常加樣過程進(jìn)行判定，并分類。吸取樣本過程完成后，加樣臂運(yùn)動部分移動加樣尖到分配樣本區(qū)域，在移動過程中對加樣槍內(nèi)部氣壓進(jìn)行并在必要時利用電機(jī)驅(qū)動活塞進(jìn)行氣壓補(bǔ)償，以避免漏液現(xiàn)象的發(fā)生。3.3.1 液位探測技術(shù)作為樣本檢測的第一步，必須進(jìn)行樣本和試劑的吸液，并且加注到反應(yīng)杯，這是一個動態(tài)的過程，而在這個過程中，液位探測是一個非常重要的環(huán)節(jié)，它能

42、保證探針迅速下降的時候，通過探測液面所在的位置來及時樣品杯或試劑瓶中是否有足夠的由各項(xiàng)目預(yù)先設(shè)定的液量可以進(jìn)行檢測，以保證吸到準(zhǔn)確的液量而又不至探的過深得以最大限度減少探針攜帶污染，特別是在使用原始管時，如果沒有液面探測，則會產(chǎn)生空吸，或者因各樣品管內(nèi)液面和血凝塊高度不定，導(dǎo)致探針扎入血凝塊，而吸不到準(zhǔn)確的血清需要量，最終造成探針堵塞。由于測試樣本總類繁多并且導(dǎo)電特性各異，采用多種模式的液位探測方法電容法和法。3.3.2技術(shù)加樣過程廣泛于化學(xué)、制藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等多個學(xué)科，并且在藥品或醫(yī)療中應(yīng)用廣泛。檢測的錯誤加樣過程會造成（尤其是藥品）的質(zhì)量問題或?qū)ξ：ΑＨ绻R床檢驗(yàn)中的加樣過程檢驗(yàn)，則可能會造成檢驗(yàn)結(jié)果錯誤，或者引起各種珍貴醫(yī)用試劑的大量浪費(fèi)，因此準(zhǔn)確及時地判定加樣過程是否正確是很重要的。采用氣動置換方式進(jìn)行加樣，當(dāng)加樣槍連接 Tip 頭剛開始接觸到液體表面時，活塞、加樣槍內(nèi)壁、液體上表面以及 Tip 頭內(nèi)壁共同組成一個封閉