1、DNA聚合酶的定義發(fā)布時間： 2010-6-3 瀏覽次數(shù)： 775 次DNA聚合酶的定義DNA聚合酶（DNApolymerase ）是細胞復(fù)制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶，以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由 5'端點開始復(fù)制到3' 端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化 DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP 等的情況下）及其相輔的活性。真核細胞有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶a （定位于 胞核，參與復(fù)制引發(fā)具5' - 3'外切酶活性），B（定位于核，參與 修復(fù)，具5' -3'外切酶活性），丫（定位于線粒體，參與線粒體復(fù) 制具5'

2、 - 3'和3' - 5'外切活性），3（定位核，參與復(fù)制，具有 3' 5'和5' -3'外切活性），£（定位于核，參與損傷修復(fù)，具有3'- 5' 和 5' - 3' 外切活性）。原核細胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長有關(guān)。DNA聚合 酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈 DNA的延長；DNA聚合酶II則 與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；DNA聚合酶III在細胞中存在的 數(shù)目不多，是促進DNA鏈延長的主要酶。DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事們就想到 DNA的

3、復(fù) 制必然是一種酶的催化作用，于是決心分離出這種酶并研究其結(jié)構(gòu)和 作用機制。為了達到這個目的，他們分離的蛋白，然后加到體外合成 系統(tǒng)中即同位素標(biāo)記的dNTR Mg蓉及模板DNA經(jīng)過大量的工作， 于 1956 年終于發(fā)現(xiàn)了 DNA聚 合酶I (DNApolymerase I, DNApol I) 原來稱為Kornberg酶。以后又相續(xù)發(fā)現(xiàn)了 DNApol H和DNApol皿。 開始人們以為DNA pol I是細菌中DNA復(fù)制主要的酶類，后來發(fā)現(xiàn) DNApol I的突變株照樣可以復(fù)制，才清楚它并不是主角?，F(xiàn)在已經(jīng) 知道在DNAM制中起主導(dǎo)作用的是 DNA pol皿，至于pol H的功能 現(xiàn)在還不十

4、分清楚。DNA聚合酶的共同特點是：(1) 需要提供合成模板；(2)不能起始新的DNA鏈，必須要 有引物提供3' - OH ( 3)合成的方向都是5' -3 (4)除聚合DNA 外還有其它功能。所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在 3' 0H上加核苷酸使鏈延伸，其速率為1000 Nt/min。加什么核苷酸 是根據(jù)和模板鏈上的堿基互補的原則而定的。E.coli的DNA pol I涉及DNA損傷修復(fù)，在半保留復(fù)制中起 輔助的作用。DNApol H在修復(fù)損傷中也是有重要的作用。DNApol皿 是一種多亞基的蛋白。在 DNA新鏈的從頭合成(de novo )

5、中起復(fù)制 酶的作用。DNA聚合酶的共性此酶最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)， 以后陸續(xù)在其他原核生物及微生物中找到。這類酶的共同性質(zhì)是：1以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體 催化合成 DNA;2 需要模板和引物的存在 ;3 不能起始合成新的 DNA 鏈;4催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3'-OH末端;5催化DNA合 成的方向是5' -3'。下面首先介紹大腸桿菌的 DNA聚合酶，然后簡 略說明一下其他原核生物的DNA聚合酶和真核生物DNA聚合酶。功能1聚合作用：在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolI逐個將核苷酸加上去，就是 DN

6、ApolI的聚合作 用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化， 促進 3'-OH 與 5'-PO4 結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入 結(jié)合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被 3'-5' 外切酶 活性位點所識別并切除之。2 3' -5'外切酶活性校對作用：這種酶活性的主要功能 是從3' -5'方向識別和切除不配對的 DNA生長鏈末端的核苷酸。當(dāng) 反應(yīng)體系中沒有反應(yīng)底物dNTP時，由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時的 游離現(xiàn)象，從而被 3&#

7、39; -5' 外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的 溫度可以促進這種作用，這表明溫度升高使DNA生長鏈3'末端與模板發(fā)生分離的機會更多， 因而降解作用加強。 當(dāng)向反應(yīng)體系加入 dNTP， 而且只加放與模板互補的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑 制，并繼續(xù)進行DNA的合成。由此推論，3' -5'外切酶活性的主要功 能是校對作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補而游離時則被3' -5'外切酶切除，以便重新在這個位置上聚合對應(yīng)的核苷酸。在某些 T4 噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株 分離得到的T4DNA聚合酶的3'

8、 -5'外切酶活性很低。相反，另外一 些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3' -5'外切酶活 性比野生型高得多，因此，其 DNA復(fù)制真實性好，變異率低?？梢?， 3' -5'外切酶活性對DNA復(fù)制真實性的維持是十分重要的。3 5' -3'外切酶活性切除修復(fù)作用:5' -3'外切酶活性就 是從5' -3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核 苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力 作用，方向是5' 3'。每次能切除10個核苷酸

9、，而且DNA的聚合作 用能刺激 5' -3' 外切酶活力達 10 倍以上。因此，這種酶活性在 DNA 損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。4 焦磷酸解作用:DNApol I的這種活性可以催化3'末端焦磷 酸解DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解 DNA生長鏈，可以認(rèn)為 是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解 DNA鏈作用需要有模板DNA 的存在。(dNMP)n+XPPi-(dNMP)n x+X(dNPPPDNA5 焦磷酸交換作用：催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為 32P32Pi+dNPPP

10、dNP32P32P+PDNA最后兩種作用，都要求有較高濃度的 PPi，因此，在體由于沒 有足夠高的 PPi 而無重要意義。DNApolI的DNA聚合酶活性和5' -3'外切酶活性協(xié)同作用，可 以使DNA鏈上的切口向前推進，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的 交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個 磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時， DNApoII 能從切口開始合成新的 NDA 鏈，同時切除原來的舊鏈。 這樣，從切口開始合成了一條與被取代的 舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣閍 -32P-dNTP,貝憧新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)

11、記的 DNA分子， 可以用作探針進行分子雜交實驗。盡管DNApolI是第一個被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸 桿菌中DNA復(fù)制的主要聚合酶。主要證據(jù)如下:1純化的DNApolI 催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體DNA合成速率要比此高二 倍數(shù)量級 ;2 大腸桿菌的一個突變株中， 此酶的活力正常， 但染色體 DNA復(fù)制不正常;3而在另一些突變株中，DNApolI的活力中只是野 生型的1%但是DNA復(fù)制卻正常，而且此突變株增加了對紫外線、 烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復(fù)制關(guān)系不大，而在 DNA修復(fù)中起著重要的作用。大腸桿菌DNA聚合酶1、大腸桿菌 DNA聚合酶1( DN

12、Apolymerasel, DNApolI)這是 1956年由ArthurKornberg 首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornber酶。 此酶研究得清楚而且代表了其他 DNA聚合酶的基本特點。(1)理化性質(zhì)：純化的DNApolI由一條多肽鏈組成，約含1000 個氨基酸殘基，M(分子量)為109KD分子含有一個二硫鍵和一個 -SH基。通過二個酶分子上的-SH基與Hg2+結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活 性。每個酶分子中含有一個 Zn2+,在DNA聚合反應(yīng)起著很重要的作 用。每個大腸桿菌細胞中含有約400個分子，每個分子每分鐘在37C 下能催化667個核苷酸摻入正在生長的DNA鏈。經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶 處理

13、后，酶分子分裂成兩個片段，大片段分子量為76KD通常稱為 Klenow片段，小片段的分子量為34KD此酶的模板專一性和底物專 一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為 底物。在無模板和引物時還可以從頭合成同聚物或異聚物。DNAPolI在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約 65A在酶的縱軸上 有一個約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位 置，在此位置上至少有6個結(jié)合位點：1模板DNA吉合位點；2DNA 生長鏈或引物結(jié)合位點 ;3 引物末端結(jié)合位點，用以專一引物或 DNA 生長鏈的3'-OH;4脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點；55'3'外切酶活

14、性 位點，用以結(jié)合生長鏈前方的5'-端脫氧核苷酸并切除之；63' -5' 外切酶活性位點，用以結(jié)合和切除生長鏈上未配對的 3'- 端核苷酸。2、大腸桿菌DNA聚合酶H (DNApolH ) : DNA聚合酶I缺陷的 突變株仍能生存，這表明 DNApoll不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。人 們開始尋找另外的DNA聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了 DNApolH。此酶 MW為120KD每個細胞約有100個酶分子，但活性只有 DNApol的 5%。該酶的催化特性如下:（1）聚合作用：該酶催化DNA勺聚合，但是對模板有特殊的要求。 該酶的最適模板是雙鏈 DNA而中間有空隙（ga

15、p）的單鏈DNA部份，而 且該單鏈空隙部份不長于100個核苷酸。對于較長的單鏈DNA模板區(qū) 該酶的聚合活性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白（SSBP）可以提高其聚合速 率，可達原來的 50-100 倍。 活性，但無5' -3'外切酶活性。（3）該酶對作用底物的選擇性較強，一般只能將 2-脫氧核苷酸 摻入到DNA鏈中。（4）該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因為此酶缺陷的大腸桿菌突 變株的DNA復(fù)制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作 用。3、大腸桿菌 DNA聚合酶皿（DNApol皿）:DNA pol皿全酶由多 種亞基組成 （見下表），而且容易分解。大腸桿菌每個細胞中只有 10-20

16、 個酶分子， 因此不易獲得純品， 為研究該酶的各種性質(zhì)和功能帶來了 許多困難。直到不久前，才對其性質(zhì)和功能有所了解，但每個亞基的 具體作用扔不十分清楚。 盡管該酶在細胞存在的數(shù)量較少， 但催化脫 氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶H的15倍和30倍。該 酶對模板的要求與DNA聚合酶H相同，最適模板也是鏈DNA中間有空 隙的單鏈DNA單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈 DNA模板的DNA 聚合作用。DNApoEI也有3' 5'和5' 3'外切酶活性，但是3' 5' 外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)?DNA只產(chǎn)生5'-單核苷酸，不會產(chǎn) 生

17、二核苷酸，即每次只能從 3' 端開始切除一個核苷酸。 5' -3' 外切 酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用 于雙鏈區(qū)。DNA聚合酶皿是細胞DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫 度突變株在限制溫度 (non permissive temperature) 是不能生長的， 此種突變株的裂解液也不能合 DNA但加入DNA聚合酶皿則可以恢復(fù) 其合成DNA的能力。DNA聚合酶皿的組成亞基分子量(X 103)其它名稱a 140 dnaE 蛋白， polC 蛋白£ 250 10t 83丫 52 dnaZ 蛋白5 32 dnaX 蛋白B 40 dn

18、aN 蛋白，copol 皿大腸桿菌三種DNA聚合酶的特性功能 poi I poi n poi 皿聚合作用5' T 3' + + +外切酶活性3' f 5' + + +外切酶活性5' f 3' +- +焦磷酸解和焦磷酸交換作用 + - +模板及引物的選擇 完整的DNA雙鏈-帶引物的長單鏈 DNA + - - 帶缺口的雙鏈 DNA + - - 雙鏈而有間障的 DNA + + +一般性質(zhì)分子量 1 09KD 120KD > 140KD每細胞中的分子量 400 17-100 10-20結(jié)構(gòu)基因 polA polB polCT4-DNA聚 合酶T4-

19、DNA聚合酶(T4-DNApol):近年來在枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏 桿菌等細胞及噬菌體T4、T5、T7中分離到NDA聚合酶，這里只介紹 T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶I相似，也是一 條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有 15 個半 胱氨酸殘基。但是，它在作用上與大腸桿菌DNApol不同;1它無5' -3'外切酶活性;2它需要一條有引物的單鏈 DNA作模板。在有缺 口的雙鏈DNA作模板時，需要有基因32蛋白的輔助(基因32蛋白在 T4DNAS制中的作用和大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白的作用相似，基因32蛋白在復(fù)制叉處和單鏈DNA結(jié)合后可以促進雙鏈的

20、進一步打開，并保 持其單鏈狀態(tài)有利于新生鏈的合成)；它利用單鏈DNA為模板進，可同 時利用它作為引物，即此單鏈 DNA的 3'端能環(huán)繞其本身的某一順序 形成氫鍵配對，3'端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的3' -5'外切 酶活性切去，然后在其作用下從 3'-OH 端開始聚合，合成該模板 DNA 的互補鏈，再以互補鏈為模板合成原來的單鏈 DNA。真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：真核生物中也具有幾種 DNA聚合酶，但 這些聚合酶都沒有3' 5'或5' 3'外切酶活性。其聚合反應(yīng)機制與 原核生物的聚合一樣。主要的

21、酶（占總量的80-90%）是DNA聚合酶a, 分子量為300KD含有4個或5個亞基，主要負(fù)責(zé)染色體DNA的復(fù)制。 DNA聚合酶B,分子量為45KD僅含有一條鏈，主要作用是修復(fù)核 DNA第三種聚合酶丫，分子量為140KD存在于線粒體，負(fù)責(zé)催化 線粒體DNA勺復(fù)制。最近從兔的骨髓細胞質(zhì)中分離到一種新的 DNA聚 合酶，這種酶與上述真核生物的DNA聚合酶不同，而與原核生物的聚 合酶類似，具有3' 5'核酸外切酶活性，稱為DNA聚合酶3。另外， 從酵母、原蟲等低真核生物中分離到一些 DNA聚合酶。一般來說，這 些低等生物都沒有低分子量的 DNA聚合酶而且與原核生物的DNA 聚合酶相似，

22、有 3' 5' 外切酶活性。實驗室常用的耐熱DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCF技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具 有 5'-3' 聚合酶活性，但不一定具有 3'-5' 和 5'-3' 的外切酶活性。3'-5' 外切酶活性可以消除錯配， 切平末端； 5'-3' 外切酶活性可以消 除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類：一、普通耐熱DNA聚合酶Taq DNA 聚合酶由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合 酶中活性最高的一種，達200,000單位/mg。具有5'-3'外切酶活性， 但不具有 3'-5' 外切酶活性，因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒有 校正功能。TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將 PCR雙鏈產(chǎn) 物的每一條鏈3'加入單核苷酸尾，故可使 PCR產(chǎn)物具有3'突出的單 A核苷酸尾；另一方面，在僅有 dTTP存在時，它可將平端的質(zhì)粒的 3'