1、NKG2D配體的表達直接影響NK細胞對不同發育階段DC的殺傷 作者：涂三芳, 郭坤元, 胡亮衫, 梅家轉, 周健, 孫明【摘要】 目的: 探討NKG2D配體在不同發育階段樹突狀細胞（DC）表面的表達及其對自然殺傷（NK）細胞殺傷活性的影響。方法: 用細胞因子（rh IL-4、 rhGM-CSF、 TNF-）體外誘導培養單核細胞來源的未成熟樹突狀細胞（iDC）和成熟樹突狀細胞（mDC）并鑒定形態和表型, 免疫磁珠法分離純化NK細胞。流式細胞術（FCM）檢測iDC和mDC表面NKG2D配體MICA/B、 ULBP1-3的表達。用LDH釋放法檢測NK細胞對iDC和mDC的殺傷活性以及抗NKG2D單克

2、隆抗體(mAb)阻斷NK細胞后的殺傷活性。結果: 培養的iDC和mDC具有典型的細胞形態和免疫表型特征。iDC表面表達MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP3, 表達率分別為(32.39±8.30）%、 (17.75±3.40)%、 (26.71±6.48)%、 (38.37±6.89)%; mDC表面表達MICA 、 ULBP3, 表達率分別為(7.82±2.67)%、 (8.36±2.42)%, 比iDC表面相應配體表達率低（P<0.01）。各效靶比NK細胞對iDC的殺傷活性均比對mDC的殺傷活性高, 差異有

3、統計學意義(P<0.01)。抗NKG2D mAb阻斷NK細胞后對iDC殺傷活性比阻斷前減弱(P<0.05); 對mDC的殺傷活性與阻斷前相比無統計學意義(P>0.05)。結論: NKG2D配體在iDC表面表達高, 介導了NK細胞對iDC的殺傷, 而對mDC的殺傷無影響, 是NK細胞對iDC選擇性高殺傷的分子機制之一。 【關鍵詞】 NKG2D配體 自然殺傷細胞 樹突狀細胞Abstract AIM: To investigate the expression of NKG2D ligands on dendritic cells（DC） at differ

4、ent development stages and its effect on cytotoxicity of natural killer（NK） cells. METHODS: The monocytes were cultured into immature dendritic cells（iDC） and mature dendritic cells（mDC） with cytokines. NK cells were obtained from normal peripheral blood by CD56 antibody magnetic isolation.The expre

5、ssion of NKG2D ligands (MICA/B, ULBP1-3) was detected by flow cytometry. Cytotoxicity of NK cells and the NK cells blocked with anti-NKG2D mAbs against iDC and mDC was tested using LDH-releasing method. RESULTS: IDC and mDC were of typical morphology and phenotypes. MICA, MICB, ULBP1, and ULBP3 were

6、 expressed on iDC and their expression rate was (32.39±8.30)%, (17.75±3.40)%, (26.71±6.48)%, (38.37±6.89)%, respectively. MICA and ULBP3 were expressed on mDC and their expression rate was (7.81±3.33)% and (8.36±2.42)%, respectively, which was lower than that on mDC (P&

7、amp;lt;0.01). At the each ET ratio cytotoxicity of NK cells against iDC was stronger than that against mDC (P<0.01). cytotoxicity of NK cells blocked with anti-NKG2D mAb against iDC was decreased compared with that of NK cells unblocked (P<0.05) while cytotoxicity of NK cells blocked w

8、ith anti-NKG2D mAb against mDC showed no decrease compared with that of NK cells unblocked (P>0.05). CONCLUSION: The expression of NKG2D ligands on iDC is higher than that on mDC, which plays an important role in the cytotoxic effect of NK cells against iDC, but has no effect on that aginst m

9、DC. NKG2D-NKG2D ligands shows one of the moleculer mechanisms that NK cells kill iDC selectivly.KeywordsNKG2D ligand; natural killer cell; dendritic cell樹突狀細胞（DC）和自然殺傷（NK）細胞是機體免疫系統最重要的組成部分, 二者之間存在相互作用1。Ruggeri等2, 3研究發現在異基因造血干細胞移植中供者NK細胞可以通過殺傷宿主DC來降低移植物抗宿主病（GVHD）的發生。但NK細胞殺傷DC的作用機制仍未完全明確。NK細胞主要通過表面受配體

10、結合起殺傷作用, 本研究旨在通過檢測NKG2D配體在不同發育階段DC表面的表達水平來探索NKG2D受配體識別途徑是否參與介導了NK細胞對不同發育階段DC的殺傷, 為臨床運用NK細胞降低GVHD的發生提供理論依據。1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640培養基和胎牛血清購自Gibco公司。重組人白細胞介素-4 ( rh IL-4)、 重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子( rhGM-CSF)和腫瘤壞死因子（TNF-）均為Pep rotech公司產品。抗CD56免疫磁珠抗體、 MACS磁柱和MACS細胞分選儀均為Miltenyi公司產品。殺傷活性檢測試劑盒（Cytotox96 non-radio

11、active cytotoxocity assay）為Promega公司產品。CD3FITC、 CD16PECD56PE mAb為BD公司產品。FITC或PE標記的鼠抗人CD80、 CD86、 HLA2DR、 CD83、 CD1a單克隆抗體(mAb)及其同型對照均為eBiosience公司產品。鼠抗人NKG2D、 MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3 mAb和FITC標記的兔抗鼠IgG1購自RnD公司。FACScabilur型流式細胞儀為Beckman-Coulter公司產品。1.2 方法1.2.1 人外周血單核細胞來源的iDC與mDC體外誘導培養與鑒定 常規分離健康

12、志愿者外周血單個核細胞, 以4×109/L細胞密度接種在6孔板中, 置于37、 50 mL/L CO2培養箱中貼壁培養4 h后, 去除非貼壁細胞, 加入含20 g/L rhIL-4、 50 g /L rhGM-CSF、 100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液, 置于培養箱培養, 隔天半量換液, 補充等量細胞因子。第6天補加80 g /L的TNF-, 共培養9 d。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態。收集第6天和第9天細胞用25 mL/L戊二醛固定, 漂洗, 脫水, 乙酸異物脂置換, 干燥, 噴金后上機用掃描電子顯微鏡觀察鑒定其形態。同樣收集第6天和第9天細胞計數后分管, 分別加C

13、D80PE、 CD86 PE-CY5、 HLA-DRPE、 CD1aFE、 CD83FITC mAb 4度標記, 對照管加同型對照IgG1, 用流式細胞術（FCM）檢測各分子的表達, 不同時間點重復3次。1.2.2 人外周血來源的NK細胞分離 分離另外3位健康志愿者外周血單個核細胞, 每107個細胞加入80 L PBS和20 L抗CD56免疫磁珠抗體, 4標記15 min后洗滌, 用500 L的PBS充分混勻后加入到磁柱中, 在MACS細胞分選儀中分離, 推注器將分選的陽性細胞推入無菌試管, 為NK細胞。CD3FITC、 CD16PECD56PE mAb標記NK細胞檢測NK細胞的純度。1.2.

14、3 iDC、 mDC表面NKG2D配體的FCM檢測 分別收集鑒定后的iDC與mDC洗滌計數, 分6管, 每管109/100 mL細胞懸液, 按1 g/106個細胞密度分別加入MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3 mAb, 4度標記30 min后洗滌, 加入FITC標記的山羊抗鼠IgG1二抗4度標記30 min, 第6管加等量同型IgG1作為陰性對照, 洗滌后以FCM檢測MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3的表達量。為避免實驗誤差, 不同時間點重復3次。1.2.4 NK細胞對iDC與mDC殺傷活性的檢測 采用LDH釋放法4, 收集iDC, mD

15、C作為靶細胞, NK細胞為效應細胞, 按照Cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay殺傷試劑盒說明書操作, 倍比稀釋法按效靶比201、 101、 51鋪板, 阻斷組先加抗NKG2D mAb 10 g/100 L常溫下孵育15 min, 封閉NK細胞表面NKG2D受體, 再加靶細胞。顯色后ELX-800酶標儀上測A值。NK細胞殺傷率=(實驗孔A值靶細胞自發釋放孔A值效應細胞自發釋放孔A值)/(靶細胞最大釋放孔A值靶細胞自發釋放孔A值)×100%1.2.5 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行數據處理, 數據以x±s表示,

16、采用獨立樣本t檢驗, P<0.05者表示差異有統計學意義。2 結果2.1 iDC和mDC的形態和表型 倒置顯微鏡下觀察第6天細胞大部分半懸浮聚集成簇生長, 胞體增大, 表面可見短小毛刺狀突起。第9天細胞大部分懸浮生長, 表面樹突結構明顯。掃面電鏡下觀察第6天細胞大小10 m左右, 表面突起短小, 多見薄沙或云霧狀皺褶, 符合iDC的形態特征（圖1A）; 第9天細胞表面突起更多更長, 呈典型樹突狀結構, 云霧狀皺褶稀疏, 符合mDC的形態特征（圖1B）。FCM結果顯示第6天DC表面共刺激分子CD80和CD86分別為（40.8±7.9）%和（45.1±3.7）%,

17、 HLA-DR表達為（59.9±5.2）%, 特異性分子標志物CD1a高表達為（71.9±5.2）%, 成熟分子標志物CD83低表達為（14.9±1.9）%, 為不成熟階段表型。第9天測得CD80、 CD86和HLA-DR表達升高為（71.5±7.3）%、 （79.9±6.7）%和（88.6±6.6）%, CD1a仍高表達, CD83表達升高為(65.5±3.8)%, 為成熟階段表型。圖1 掃描電鏡下觀察DC形態（略）Fig 1 The morphologies of DC observed by scanning elec

18、tron microscopeA: Day 6; B: Day 9.2.2 NK細胞的純度 FCM結果顯示外周血單個核細胞經免疫磁珠分選后NK細胞（CD3-CD16+CD56+）的純度為（91.66±4.04）%, 能滿足實驗要求（圖2）。圖2 免疫磁珠法分選后NK細胞的純度（略）Fig 2 Purification of NK cells after immunomagnetic isolation2.3 iDC和mDC表面NKG2D配體的表達 iDC表面表達MICA、 MICB、 ULBP1和ULBP34個配體; mDC表面只表達MICA、 ULBP22個配體, 且比iDC表面相

19、應配體表達率低, 差異均有統計學意義（P<0.01）。其他配體表達率均低于5%, 視為陰性結果(表1, 圖3)。表1 NKG2D配體在iDC和mDC表面的表達率（略）Tab 1 Expression of NKG2D ligands on the surface of iDC and mDCbP<0.01 vs iDC.圖3 iDC和mDC膜表面NKG2D配體的表達（略）Fig 3 Expression of NKG2D ligands on the surface of iDC and mDC2.3 NK細胞對iDC與mDC的殺傷活性 各效靶比NK細胞對iDC的殺

20、傷活性分別高于對mDC的殺傷活性, 差異均有統計學意義（P<0.01）。NKG2D mAb阻斷NK細胞后, 各效靶比NK細胞對iDC的殺傷活性降低（P<0.05）; 對mDC的殺傷活性與阻斷前相比均無統計學意義（P>0.05）; 阻斷后的NK細胞對iDC的殺傷活性比阻斷前NK細胞對mDC的殺傷活性高, 差異有統計學意義（P<0.05, 圖4）。圖4抗NKG2D mAb阻斷前后NK細胞對iDC和mDC的殺傷活性（略）Fig 4 Cytotoxicity of NK cells and the NK cells blocked with an

21、ti-NKG2D mAb against iDC and mDC3 討論 NK細胞和DC是機體天然免疫和獲得性免疫系統中重要的組成部分, 近年來研究1, 5表明二者在天然免疫早期階段存在相互作用, DC能增強NK細胞的殺傷活性, 同時NK細胞能選擇性殺傷iDC, 到目前為止其殺傷機制仍在探索中。DC根據發育階段的不同可分為iDC和mDC, 其在形態, 表型和功能上有所不同6。NK細胞的殺傷活性同時受活化性和抑制性受配體結合產生的信號平衡調節起作用7, 其活化性受體主要包括II型跨膜蛋白受體NKG2D和NK細胞自然細胞毒受體NCR, 與配體結合向NK細胞傳遞活化性信號。NKG2D配體8主要包括多

22、態性的MHC-I類鏈相關的肽A、 B（MICA/B）和人巨細胞病毒UL16結合蛋白(ULBPs), 它們在不同發育階段DC的表達情況尚未見研究報道。我們通過FCM分別檢測iDC和mDC表面NKG2D配體的表達, 結果顯示iDC表面表達MICA、 MICB、 ULBP1和ULBP3, 而mDC表面只表達MICA和ULBP3, 且表達率很低。因此iDC可以通過表面NKG2D配體與NKG2D結合激活NK細胞的殺傷活性, mDC通過NKG2D配體很難激活NK細胞。本研究殺傷試驗顯示NK細胞對iDC的殺傷活性比對mDC的殺傷活性高很多, 與其他研究結果一致9。NKG2D mAb阻斷NK細胞后降低了NK細

23、胞對iDC的殺傷活性, 但對mDC的殺傷沒有影響。因此可認為NKG2D受配體識別信號途徑介導了NK細胞對iDC的殺傷, 沒有介導對mDC的殺傷, 是NK細胞選擇性高殺傷iDC的機制之一。 NK細胞的殺傷作用除了受活化性信號作用之外, 同時受抑制性信號的共同調節作用。NK細胞抑制性信號受體主要包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體KIR和CD94/NKG2A等, 分別與靶細胞表面的HLA-類分子和不典型的I類分子結合, 向NK細胞傳遞抑制性信號10。本研究結果顯示抗NKG2D mAb阻斷后對iDC的殺傷活性仍比未阻斷前NK對mDC的殺傷活性高, 說明抗NKG2D mAb不能完全阻斷NK細胞對iDC的殺傷,

24、 同時其他受配體識別途徑介導。除了其他活化性信號途徑外, 更主要的就是抑制性信號在二者強弱不等。Ferlazzo等11發現mDC高表達抑制性配體MHC-I類分子, 而iDC低表達, 這可能也是iDC被NK細胞選擇性殺傷的原因之一。 在異基因造血干細胞移植中利用NK細胞對iDC 的殺傷清除能力, 輸入KIR/HLA錯配的NK細胞可能做為一種安全有效的過繼細胞免疫治療方法用于白血病的治療, 降低GVHD的發生。本研究發現NKG2D配體在iDC表面表達, 并首次證實它直接影響NK細胞對iDC的選擇性殺傷, 為臨床造血干細胞移植合理選擇供者提供了一定的理論依據。【參考文獻】 1 Moretta L,

25、Ferlazzo G, Bottino C, et al. Effector and regulatory events during natural killer-dendritic cell interactionsJ. Immunological Reviews, 2006, 214（10）: 219-228.2 Ruggeri L, Mancusi A, Burchielli E, et al. Natural killer cell alloreactivity and haplo-identical hematopoietic transplantationJ. Cytothera

26、py, 2006, 8(6): 554-558.3 Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplantsJ. Sience, 2002, 295(5562): 2097-2100.4 梅家轉, 周 健, 郭坤元, 等. 低表達MICA/MICB導致NK細胞對人鼻咽癌多藥耐藥細胞（CNE2/DDP）殺傷活性下降J. 中國腫瘤生物治療雜志, 2006, 13（5）: 349-352

27、.5 Capobianco A, Rovere-Querini P, Rugarli C, et al. Multidirectional interactions are bridging human NK cells with plasmacytoid and monocyte-derived dendritic cells during innate immune responsesJ. Intrenatinal J Cancer, 2006, 119(12): 2861-2869.6 Karolina A, Nicolas T, Sanchez-Chapuis F, et al. Dendritic cells a