1、動物細胞染色體熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)FISH（fluorescence in situ hybridization）技術是一種重要的非放射性原位雜交技術，其基本原理是利用被檢測的染色體上的靶DNA與所用的核酸探針（probes）間的序列同源互補性，經“變性退火復性”，形成靶DNA與核酸探針的雜交體關鍵詞：動物細胞染色體熒光原位雜交fluorescenceinsituhybridizationFISH核酸探針probes實驗目的：使學生掌握染色體熒光原位雜交(fluorescence in s

2、itu hybridization, FISH) 分析技術，了解染色體熒光原位雜交分析技術的應用價值。實驗原理：FISH（fluorescence in situ hybridization）技術是一種重要的非放射性原位雜交技術，其基本原理是利用被檢測的染色體上的靶DNA與所用的核酸探針（probes）間的序列同源互補性，經“變性退火復性”，形成靶DNA與核酸探針的雜交體（圖22-1）。核酸探針既可以直接用熒光分子標記，也可以在先標記上報告分子如生物素、地高辛，再使報告分子與熒光素標記的特異親和素或抗體發生免疫化學反應，最后經熒光顯微鏡對靶DNA進行定性、定量或相對定位分析（圖22-2）。 F

3、ISH是目前進行細胞遺傳學研究最為有效的手段，不僅可以研究分析染色體減數分裂過程的行為和不同基因組染色體交叉互換的現象，也是研究基因組分化的重要工具，甚至可以篩選出染色體標記的種特異性重復序列。FISH為研究染色體上DNA的序列提供了一個最直接的方法。具有經濟、安全、快速、穩定，靈敏度高等優點。FISH中使用的探針有：（1）基因組探針（genomic probe）：人類基因組內一些高頻率的重復序列，在進化上很少具有保守性。若以基因組DNA作為探針，這些存在于探針和靶細胞DNA序列中的高度重復序列之間會首先退火結合，越過那些保守的和單一的序列，故雜交會呈現出種特異性。基因組重復序列包括：著絲點重

4、復（Centromere repeats ）、端粒重復（Telomere repeats）、核糖體DNA（Ribosomal DNA，rDNA）、Interspersed repetitive elements (SINEs, LINEs)等（圖22-3、4）。（2）染色體特異性序列探針（probe recognizing chromosome specific sequences)：目前在人幾乎所有染色體中已經克隆出一些重復序列，重復一百到五千次不等，各具染色體特異性。大多在某一染色體的著絲粒區或異染色質區產生致密的雜交帶。從而可特異性地識別某一染色體（圖22-5）。（3）染色體文庫探針（c

5、hromosome labraries probe）：染色體文庫收集人類單條染色體的DNA作為探針，又稱整體染色體探針。單條染色體的獲得一般有兩種方法：來自僅攜有某一條人類染色體的體細胞雜交株，或經流式細胞分類儀從染色體懸液中分離。（4）單一序列探針（single-copy sequences probe）：FISH有一弱點，就是要求探針足夠大，探針越小，雜交位點檢出率就越低。欲利用FISH檢測存在基因組內的單一序列基因，最有效的方法是應用含大插入片段的克隆載體，如全Cosmids（載約40kb的插入片段），更大的YAC載體（載100-800kb插入片段）。若掌握好，小到2kb的質粒探針亦可用

6、FISH方法定位，但效率較低（圖22-6）。圖22-224色mFISH（Multicolor FISH）核型分析技術是近年建立的一種新技術。其原理是使用5種熒光染料按比例標記探針，雜交后形成24條染色體各自呈現特異的熒光色彩以供核型分析（圖22-7，8）。為研究人員提供了更豐富詳盡的細胞遺傳學信息，包括確定標記染色體的來源、檢測微小的染色體易位和檢測復雜的染色體易位，尤其為腫瘤細胞染色體分析提供了全新、高效的方法。FISH的應用領域有： (1)基因定位與基因制圖（gene mapping）。FISH已經極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進程。(2)基因診斷(gene diagnosis)。精

7、確、直觀、明了；(3)間期細胞遺傳學（interphase cytogenetics）；(4)FISH在腫瘤生物學中的應用：腫瘤細胞遺傳學（onco-cytogenetics）；基因定位：FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位；病毒基因插入基因組部分的檢測。利用FISH可以檢測到病毒整合到人基因組中的情況，對深入研究病毒致癌機理，以及檢測、防治腫瘤均具有重要意義；基因的擴增與缺失：原癌基因的激活與抑癌基因的失活是目前腫瘤研究的熱點。已知原癌基因的激活方式有：突變、基因擴增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：點突變、基因缺失。FISH為研究基因的擴增和缺失提供了新的方法，能將基因

8、擴增和染色體重復分開。 圖22-3 Telomeres FISH圖22-4 FISH with repetitive probes to human chromosomes(a) FISH with a "pan-centromeric" probe delineates all centromeres.(b) A probe containing the highly conserved repetitive sequence hybridized to all telomeres. (c) A rDNA probe hybridized to all human NOR

9、 bearing chromosomes (chromosome 13-15, 21,22). (d) FISH with the disperse repetitive Alu mimics a R banding pattern.（From：） 圖22-5 Human chromosome 1圖22-6 特異位點定位BAC FISH圖22-7 24色染色體mFISH核型分析圖22-8實驗試劑：1.-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）2.細胞的培養、秋水仙素處理、低滲及固定處理試劑同實驗27。3.端粒DNA檢測探針：5-FITC-CCCTAACCCTAACCCTAA-3；FITC的激發波長為

10、494nm和發射波長518nm。探針在合成時，同時進行5 末端的生物素（biotin）、或地高辛（DIG）、或熒光標記（如FITC、Cy3等）標記。注意： DNA探針標記物熒光檢測的熒光分子激發和發射波長不能和復染液中DAPI染料的激發和發射波長重疊，應有較大差值，避免相互干擾。4.鮭魚精DNA（Salmon Sperm DNA）：超聲打碎。5.20×SSC（pH7.0）：3M NaCl，0.3M 檸檬酸鈉（sodium citrate），NaOH 調pH為7.0，高壓滅菌，室溫保存。6.甲酰胺（formamyde） （去離子，pure）7.50% 硫酸葡萄糖（Dextran Sol

11、fate）8.250mM 磷酸鈉（sodium phosphate）(pH7.0)9.Hybridization buffer：50% deionized formamide, 2×SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 7.0), 5% dextran sulfate, and 3 ng/ml probe.10.變性液A：70%甲酰胺，2×SSC，用1M HCl調pH到7.0，加入50mM 磷酸鈉以維持pH。11.漂洗液A：30%50甲酰胺，2×SSC；用1M HCl調pH到7.0。12.漂洗液B：0.11×SSC；用1M HC

12、l調pH到7.0。13.漂洗液C：2×SSC，0.1 Tween20；用1M HCl調pH到7.0。14.封閉液：5% BSA或脫脂奶粉，4×SSC15.復染液：2×SSC，0.1 Tween20，200ng/ml DAPI。也可以使用10 ng/ml碘化丙錠（PI）或Hoechst33258（500ng/ml）。DAPI，即4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole）。DAPI是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料。和雙鏈DNA結合后可以產生比DAPI自身強20多倍的熒光。和EB (ethidium b

13、romide) 相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。DAPI的最大激發波長為340nm，最大發射波長為488nm；DAPI和雙鏈DNA結合后，最大激發波長為364nm，最大發射波長為454nm。 DAPI溶液用水配制。用于細胞核染色時，推薦的DAPI工作濃度為0.5-10g/ml。Hoechst 33258，也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258。Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。Hoechst 33258染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33258也常用于普通的細胞核染

14、色，或常規的DNA染色。Hoechst 33258的最大激發波長為346nm，最大發射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結合后，最大激發波長為352nm，最大發射波長為461nm。Hoechst 33258溶于水，溶解度可達10mg/ml。 用于細胞核染色時，推薦的Hoechst 33258工作濃度為0.510g/ml。16.封片液：2.5% DABOCO或1%鄰苯胺二鹽酸，200mM Tris-HCl, pH8.6, 90%甘油。17.coplin jar：實驗步驟：1.從體外培養的貼壁細胞準備的中期染色體標本：A.細胞的培養、秋水仙素處理、低滲處理、固定處理同實驗21

15、。B.載玻片用硫酸洗液浸泡過夜，清洗烘干，在5% APTES-乙醇溶液中60處理3h，取出清洗，70干燥備用。C.將固定后的細胞滴于APTES修飾的載玻片上, 空氣干燥。D.脫水：70%、90%和100%乙醇脫水，每次5 min，空氣干燥。注意：室溫下玻片標本可保存數天到數周；若載玻片要長期保存，應在室溫下過夜使組織“老化”（aged），然后放入容器中，該容器密封于含干燥劑的塑料袋內，-70保存。-20保存的玻片可在6個月內使用；-70可保存一年以上；但標本一旦溶化，則不能在此冷凍。2.染色體標本變性及脫水：A.載玻片靜置60烤箱孵育預熱。B.變性液A在水浴中加熱至70。C.將染色體標本載玻片

16、浸入變性液A中，70作用2min。D.脫水：立即將載玻片依次移入冰冷的70、90及100乙醇中，各保持5min。空氣干燥玻片。3.探針雜交液的準備（10l/片）：A.1020ng 探針DNA和13g 鮭魚精DNA 混合，熱塊干燥DNA。B.DNA中加入67l甲酰胺，懸浮DNA， 保持30min。C.DNA溶液中加入1l 20×SSC （終濃度2×SSC）、2l硫酸葡萄糖（終濃度10%）、1l 250mM磷酸鈉（終濃度25mM）。保持30min。D.75變性DNA探針5min。4.染色體標本的雜交：A.將10l含變性探針的雜交液加至載玻片的變性靶DNA上。B.在雜交液液滴上小

17、心地蓋上18×18cm的蓋玻片，避免壓入氣泡。C.載玻片置于濕盒內，37溫育過夜。D.雜交結束前，42水浴預熱漂洗液A，60水浴預熱漂洗液B。E.載玻片移入42預熱的漂洗液A中，在42水浴中振蕩10min直至蓋玻片脫落。F.載玻片移入另一份42預熱的漂洗液A中，振蕩5min，更換漂洗液A兩次，每次振蕩5min。G.載玻片移入含60預熱的漂洗液B中，漂洗5min，更換漂洗液兩次，每次漂洗5min。若DNA探針用熒光標記，則無需進行下列檢測步驟，可直接進行顯微鏡熒光觀察。5.染色體標本的檢測：A.載玻片滴加50200l封閉液，22×40mm蓋玻片覆蓋，置濕盒內，37溫育至少30

18、min。取出載玻片，無菌水輕輕沖去蓋玻片。B.用封閉液配制的檢測化合物溶液（120g/ml）。如熒光素偶聯的鏈親和素（streptavidin），或抗地高辛抗體（Anti-DIG-fluorescent-conjugate）溶液。C.載玻片上滴加50l含熒光標記分子的檢測液，22×40mm蓋玻片覆蓋，置濕盒內， 37溫育30min，或室溫放置1h。D.取出載玻片，無菌水輕輕沖去蓋玻片；將載玻片移入漂洗液C中，42振蕩漂洗3次，每次5min。6.將載玻片置入含復染液中，室溫振蕩20min。7.將載玻片移入漂洗液C中，室溫溫育12min。8.載玻片上滴加1050l甘油封片液，22

19、5;40mm蓋玻片覆蓋，用潔凈指甲油封閉玻片。玻片在-20或-70暗處保存數天或數月。注意事項：1.進行熒光物質的實驗步驟時，采取避光措施。2.DAPI對人體有一定刺激性，請注意適當防護。3.原位雜交最好使用易透過細胞膜進入胞內或核內的寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80150bp）。4.原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.55.0g/ml。5.最適復性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：TOR=Tm25。6.苛刻復性溫度：Ts = Tm (10或15)7.非苛刻復性溫度：Tns =Tm (30或35)參考文獻：Fluoresce

20、nce in situ hybridization. Nature Methods 2005, 2(3): 237-238示例圖片： In situ hybridization of a-satellite probes to human chromosomes 1, 15 and 17 detected by tyramide signal amplification. a-Satellite probes to chromosomes 1, 15 and 17 were labeled by nick translation with biotin-11-dUTP, Texas Red-1

21、2-dUTP and Oregon Green 488-5-dUTP, respectively. Following simul¬taneous hybrid¬ization of all three probes, the biotin¬ylated chromosome 1 probe was detected with HRPstreptavidin conjugate and Alexa Fluor 546 tyramide. HRP activity from this first TSA detection step was then quenched