1、第六章 無病毒植物的培養教學目的和要求教學目的和要求 (1）了解植物病毒的危害和培養無病）了解植物病毒的危害和培養無病毒植物的意義。毒植物的意義。（2）理解和掌握脫除植物病毒的原理）理解和掌握脫除植物病毒的原理及方法。及方法。 （3）分離莖尖及培養方法。）分離莖尖及培養方法。（4）掌握無毒苗木的鑒定方法。）掌握無毒苗木的鑒定方法。（5）掌握脫毒苗木的保存和利用方法。）掌握脫毒苗木的保存和利用方法。第一節 植物病毒的危害和培養無病毒植物的意義 病毒之所以致病不是由于消耗細胞養分、通過毒素殺死細病毒之所以致病不是由于消耗細胞養分、通過毒素殺死細胞，而是利用細胞內物質繁殖，胞，而是利用細胞內物質繁殖

2、，干擾細胞的代謝過程干擾細胞的代謝過程，在寄主，在寄主細胞內產生一些對細胞正常功能細胞內產生一些對細胞正常功能有害的異常物質和條件，有害的異常物質和條件，這使這使得植物病毒病的防治較其他植物病害防治更為困難，常給生產得植物病毒病的防治較其他植物病害防治更為困難，常給生產帶來災難的損失，被稱為帶來災難的損失，被稱為“植物的癌癥植物的癌癥”。一、植物病毒的危害一、植物病毒的危害 植物病毒已超過植物病毒已超過600種種，嚴重危害著農業生產。，嚴重危害著農業生產。 在在果樹、蔬菜、花卉、林木以及農作物上皆有發現。果樹、蔬菜、花卉、林木以及農作物上皆有發現。隨著生產栽培時間的推移，危害越來越嚴重，發現的

3、病隨著生產栽培時間的推移，危害越來越嚴重，發現的病毒種類也越來越多。毒種類也越來越多。病毒癥狀危害園藝植物的病毒數目危害園藝植物的病毒數目如侵染菊花的病毒和類病毒有如侵染菊花的病毒和類病毒有19種之多種之多 如如 無子病毒無子病毒(CAV) 潛隱病毒潛隱病毒(CLV) B病毒病毒(CVB) 輕斑駁病毒輕斑駁病毒(CMMV) 矮化病毒矮化病毒(CSV) 脈斑駁病毒脈斑駁病毒(CVMV) 退綠斑駁類病毒退綠斑駁類病毒(CCMV)等等 4種病毒對草莓生產造成種病毒對草莓生產造成重大影響重大影響: 斑駁病毒（斑駁病毒（SMoV） 草莓黃邊病毒（草莓黃邊病毒（SMYEV ） 草莓鑲脈病毒（草莓鑲脈病毒（

4、SVBV） 草莓皺縮病毒草莓皺縮病毒 （SCrV）、）、甘薯根腐病.甘薯葉點病甘薯枯萎病甘薯黑痣病2.病毒的特性及其侵染病毒的特性及其侵染 多數植物病毒多數植物病毒不經種子不經種子傳播，多數以種子繁殖后代的植物，可以從傳播，多數以種子繁殖后代的植物，可以從輕度染病植株上采集種子，播種繁殖，不會將病毒傳至下一代輕度染病植株上采集種子，播種繁殖，不會將病毒傳至下一代。（專化性強的病毒除外，如豆類病毒（專化性強的病毒除外，如豆類病毒由一種專化性強的蚜蟲傳由一種專化性強的蚜蟲傳播播)可隨著種子傳播。）可隨著種子傳播。） 對于有性生殖退化，僅能用無性繁殖方法繁殖的植物，一旦染病對于有性生殖退化，僅能用無

5、性繁殖方法繁殖的植物，一旦染病則毫無辦法。母株一旦染病，病毒在其細胞內增殖，并則毫無辦法。母株一旦染病，病毒在其細胞內增殖，并通過插條、通過插條、接穗、種薯、球根、鱗片傳至下一代。接穗、種薯、球根、鱗片傳至下一代。 通過通過昆蟲昆蟲作為媒介加速傳播。作為媒介加速傳播。.植株脫病毒的意義植株脫病毒的意義 植物組織培養脫病毒技術是植物細胞工程的重要組成部分，脫植物組織培養脫病毒技術是植物細胞工程的重要組成部分，脫毒種苗的生產在毒種苗的生產在提高作物質量和產量提高作物質量和產量方面已顯示出極大潛力，方面已顯示出極大潛力，良種、良種、新品種的脫毒組培苗的大面積推廣和應用新品種的脫毒組培苗的大面積推廣和

6、應用，有效地解決了因病毒引，有效地解決了因病毒引起的品種起的品種退化退化問題。因此，植物組培脫毒技術在農業生產的科學化、問題。因此，植物組培脫毒技術在農業生產的科學化、現代化中具有巨大的應用價值和經濟效益，還可減少農藥的施用，現代化中具有巨大的應用價值和經濟效益，還可減少農藥的施用，改善生態環境條件，防止病害的蔓延與擴散，改善生態環境條件，防止病害的蔓延與擴散，該方法已成為農業中該方法已成為農業中應用最廣泛的生物技術。應用最廣泛的生物技術。脫毒苗脫毒苗病毒活力與溫度的關系第二節二節 脫除植物病毒的原理及方法脫除植物病毒的原理及方法 一、物理學方法：一、物理學方法： X射線射線 紫外線紫外線 超

7、短波超短波 高溫高溫 都能使病素鈍化，其中以熱處理最常用。都能使病素鈍化，其中以熱處理最常用。1.熱處理脫除植物病毒的原理熱處理脫除植物病毒的原理病毒是病毒是DNA大分子，病毒進入植物細胞后；隨植物細胞的大分子，病毒進入植物細胞后；隨植物細胞的DNA一起復制。熱處理并不能殺死病毒，只能一起復制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒的活鈍化病毒的活性性，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，而失去侵染的，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，而失去侵染的能力。能力。 熱處理是一種物理效應，與冷處理一樣，它可以加速植物細熱處理是一種物理效應，與冷處理一樣，它可以加速植物細胞的分裂，使植物細胞在與病毒繁殖

8、的競爭中取勝。胞的分裂，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。（1）溫湯浸漬處理法：）溫湯浸漬處理法：將剪下的接穗或種植材料，在將剪下的接穗或種植材料，在50左右的溫水中，浸漬左右的溫水中，浸漬3-15分鐘至數小時。分鐘至數小時。（2）熱風處理法：）熱風處理法：讓盆載植物在讓盆載植物在35-40高溫下生長發育，高溫下生長發育，熱處理空氣溫度應逐漸升高，然后達到所需溫度，同時熱處理空氣溫度應逐漸升高，然后達到所需溫度，同時必須保持一定的濕度和光照，以后可切取處理后新長出必須保持一定的濕度和光照，以后可切取處理后新長出的枝條作接穗和砧木，或將熱處理與組織培養結合效果的枝條作接穗和砧木，或將熱處理與組

9、織培養結合效果更好。更好。熱處理脫毒熱處理脫毒2、愈傷組織熱處理脫毒法、愈傷組織熱處理脫毒法 方法：方法：從患病植株上取葉片從患病植株上取葉片(莖片、鱗片、花器亦莖片、鱗片、花器亦可可)進行離體培養，誘導形成愈傷組織，然后將愈進行離體培養，誘導形成愈傷組織，然后將愈傷組織反復繼代培養同時兼用熱處理。傷組織反復繼代培養同時兼用熱處理。 常用處理溫度及處理時間：常用處理溫度及處理時間： 溫度：溫度：37-38 時間：處理時間：處理2周、周、4周或周或8周周 溫度：溫度：50 時間：時間：3-15min。 反復繼代兼熱處理，經歷一定的時間反復繼代兼熱處理，經歷一定的時間(繼代次數繼代次數需試驗需試驗

10、)后，將熱處理過的愈傷組織轉移到分化培后，將熱處理過的愈傷組織轉移到分化培養基中，誘導器官分化。養基中，誘導器官分化。果樹作物：果樹作物：桃桃(無黃萎病無黃萎病)、蘋果、蘋果(花葉病花葉病)、葡萄葡萄(扇葉病毒扇葉病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、樹莓、紅莓苔子、草莓等。栗、梨、樹莓、紅莓苔子、草莓等。蔬菜作物：蔬菜作物：馬鈴薯、番茄、菠菜。馬鈴薯、番茄、菠菜。花卉植物：花卉植物：蔓生長春花、康乃馨、菊花等。蔓生長春花、康乃馨、菊花等。其他植物：其他植物：曼陀羅等。曼陀羅等。例：煙草愈傷組織兼熱處理鈍化煙草花葉病毒例：煙草愈傷組織兼熱處理鈍化煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜

11、花葉病毒和黃瓜花葉病毒(CMV)獲得無病毒株效果做法：獲得無病毒株效果做法：A：從患病煙草植株上取：從患病煙草植株上取5mm葉片培養，在葉片培養，在MS附附加加IAA 2mg/L+KT 0.2mg/L的培養基上誘導愈傷的培養基上誘導愈傷組織。組織。B：將其中一部分愈傷組織反復繼代培養，繼代培：將其中一部分愈傷組織反復繼代培養，繼代培養中分別兼用養中分別兼用25、30和和37溫度熱處理溫度熱處理8周周。C：將熱處理后的愈傷組織，轉到：將熱處理后的愈傷組織，轉到MS附加附加IAA 2mg/L+KT 2mg/L的分化培養基中誘導芽分化。的分化培養基中誘導芽分化。D：將：將1cm長的芽轉移到長的芽轉移

12、到MS附加附加IAA 2mg/L+KT 0.02mg/L生根培養基，誘導根分化。生根培養基，誘導根分化。E：完整植株獲得后，移植到無毒土壤栽培并進行：完整植株獲得后，移植到無毒土壤栽培并進行鑒定。鑒定。 結果表明：反復繼代培養可獲得無病毒株。結果表明：反復繼代培養可獲得無病毒株。3.低溫處理脫除病毒 菊花植株菊花植株-5,4-7.5個月處理后進行莖尖培養個月處理后進行莖尖培養,可可以除去矮化病毒以除去矮化病毒(CSV)和褪綠班駁病毒和褪綠班駁病毒(CCMV),而單獨的莖尖培養無此效果。而單獨的莖尖培養無此效果。二、化學方法二、化學方法使用農藥是防治植物真細菌病害的主要方法，使用農藥是防治植物真

13、細菌病害的主要方法，理論上講，也應該是防治病毒的有效途徑。理論上講，也應該是防治病毒的有效途徑。有不少化學物質能抑制病毒復制，例如孔雀綠、有不少化學物質能抑制病毒復制，例如孔雀綠、硫尿嘧啶、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、以及某些病毒抑制劑。氮鳥嘌呤、以及某些病毒抑制劑。如如Viraz01e(病毒唑病毒唑)和一些蛋白質、核酸合成抑和一些蛋白質、核酸合成抑制劑等。由于病毒的復制和寄主的代謝過程制劑等。由于病毒的復制和寄主的代謝過程關系非常密切，因此，要找出既干擾病毒復關系非常密切，因此，要找出既干擾病毒復制，又不影響寄主細胞正常代謝的藥劑十分制，又不影響寄主細胞正常代謝的藥劑十分困難。困難。利用這些化合

14、物處理整株植物去病毒的效利用這些化合物處理整株植物去病毒的效果雖不理想，但果雖不理想，但培養離體的組織、細胞培養離體的組織、細胞和原生質體等卻可能有良好效果和原生質體等卻可能有良好效果。如在培養基中加入如在培養基中加入2硫尿嘧啶硫尿嘧啶可以除去煙可以除去煙草愈傷組織中的草愈傷組織中的PVY病毒，加入病毒，加入放線菌放線菌素素D可以抑制原生質體中的病毒復制等。可以抑制原生質體中的病毒復制等。 鈍化、抑制和清除植物病毒的一些化合物三、生物學方法三、生物學方法1.莖尖培養脫毒莖尖培養脫毒（1）莖尖培養脫毒的理論基礎）莖尖培養脫毒的理論基礎a、病毒在植物體內的轉移是通過維營束系統完成的，在分生組織、病

15、毒在植物體內的轉移是通過維營束系統完成的，在分生組織區域內沒有維管束組織，病毒只能通過胞間連絲傳遞趕不上細區域內沒有維管束組織，病毒只能通過胞間連絲傳遞趕不上細胞的不斷分裂和活躍的生長速度；胞的不斷分裂和活躍的生長速度；b、在分裂旺盛的分生組織內，病毒的復制受到旺盛代謝活動的限、在分裂旺盛的分生組織內，病毒的復制受到旺盛代謝活動的限制；制；c、在植物分生區域內，、在植物分生區域內，“病毒鈍化體系病毒鈍化體系”的活性較其他部位的活的活性較其他部位的活性高；性高；d、莖尖分生組織內高濃度的植物內源激素可能會抑制病毒的增殖。、莖尖分生組織內高濃度的植物內源激素可能會抑制病毒的增殖。 （2）莖尖培養脫

16、毒苗的方法）莖尖培養脫毒苗的方法在解剖鏡下剝取莖尖。考慮到脫毒效果及提高成活率，一般切取在解剖鏡下剝取莖尖。考慮到脫毒效果及提高成活率，一般切取0.20.5mm的莖尖為組織材料進行培養，不同的植物莖尖對外源的莖尖為組織材料進行培養，不同的植物莖尖對外源激素的反應不同。激素的反應不同。莖尖大小莖尖大小:過大時接種易成活，但脫毒效果差，過小時難成活，但過大時接種易成活，但脫毒效果差，過小時難成活，但脫毒效果好。一般以帶有脫毒效果好。一般以帶有1-2片葉原基為好，大小為片葉原基為好，大小為0.2-0.3mm為為宜，超過宜，超過0.5mm時，脫毒效果差。時，脫毒效果差。培養基培養基:只要能使莖尖快速生

17、長，分化快的培養基均適于脫毒。一只要能使莖尖快速生長，分化快的培養基均適于脫毒。一般以般以MS較好，添加一定比例的細胞分裂素就行。較好，添加一定比例的細胞分裂素就行。馬鈴薯馬鈴薯的芽的芽莖尖的結構莖尖的結構V i rus el i m i nati onw hy does the m eri stem have l ow /no vi rus ti tre? vi rus spreads pri m ari l y through vascul ar system -thi s i s not devel oped i n the m eri stem m i tosi s and chrom

18、 osom e repl i cati on com pete w i th vi rus repl i cati on hi gh auxi n i n m eri stem i nhi bi ts vi rus repl i cati on a vi rus “ i nacti vati ng” system has greatest acti vi ty i n m eri stemTobacco m eri stemvi rus-freeti ssuevi rus parti cl esfound here微莖尖微莖尖普通莖普通莖尖尖馬鈴薯脫馬鈴薯脫毒苗毒苗康乃馨不同莖尖培養與康乃馨斑

19、駁病毒的脫除情況康乃馨不同莖尖培養與康乃馨斑駁病毒的脫除情況(3)莖尖培養法脫除植物病毒的技術關鍵莖尖培養法脫除植物病毒的技術關鍵同一種病毒在不同植物體內分布部位不同。同一種病毒在不同植物體內分布部位不同。例：煙草花葉病毒例：煙草花葉病毒(TMV)在如下植物中的熒光反應。在如下植物中的熒光反應。 煙草：煙草：l-4片葉原基中未見片葉原基中未見TMY特異熒光特異熒光 撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見TMV特異熒特異熒 光，而在三四片葉原莖中可見光，而在三四片葉原莖中可見TMV熒光。熒光。 番茄：番茄：1片葉原莖中未見片葉原莖中未見TMV特異熒光。特異熒光。 所以在用莖尖培

20、養脫毒時，必須認真確定病毒在植物莖尖中的分所以在用莖尖培養脫毒時，必須認真確定病毒在植物莖尖中的分布部位，然后確定培養莖尖的大小布部位，然后確定培養莖尖的大小. 番茄：只能取生長錐或僅帶一片葉原基的莖番茄：只能取生長錐或僅帶一片葉原基的莖 尖進行培養；尖進行培養； 撞羽矮牽牛：可取生長錐或帶一兩片葉原基撞羽矮牽牛：可取生長錐或帶一兩片葉原基 的莖尖進行培養；的莖尖進行培養； 煙草：可取帶煙草：可取帶4片葉原基的莖尖進行培養。片葉原基的莖尖進行培養。 利用莖尖培養法脫除植物病毒時，最好找出莖原基利用莖尖培養法脫除植物病毒時，最好找出莖原基所帶葉原基的數目與生長點所帶葉原基的數目與生長點(莖尖莖尖

21、)大小的相關性，大小的相關性，這樣在取材時就方便多了。這樣在取材時就方便多了。 莖原基莖原基 0.050.08mm 莖原基帶莖原基帶2片葉原基片葉原基 0.10.2mm 莖原基帶莖原基帶4片葉原基片葉原基 0.30.4mm 莖原基帶莖原基帶6片葉原基片葉原基 0.60.8mm不同病毒種類在同一種植物中分布部位不同。甘薯甘薯 斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒：斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒： 分布于分布于1.0- 2.0mm以內的莖尖中以內的莖尖中 羽毛狀花葉病毒：羽毛狀花葉病毒： 分布于分布于0.3-1.0mm以內莖尖中以內莖尖中 馬鈴薯馬鈴薯 馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯卷葉病毒、Y病毒：病毒： 分布于分布

22、于1.0-3.0mm以內的莖尖中；以內的莖尖中； X病毒：病毒：分布于分布于0.2-0.5mm以內的莖尖以內的莖尖 G病毒：病毒：分布于分布于0.2-0.3mm以內的莖尖以內的莖尖 S病毒：病毒：0.2mm以下以下 2.愈傷組織培養脫毒愈傷組織培養脫毒植物各部位器官和組織培養去分化誘導產生愈傷組織，植物各部位器官和組織培養去分化誘導產生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產生芽，長成小植株，可以得到然后從愈傷組織再分化產生芽，長成小植株，可以得到無病毒苗。無病毒苗。說明病毒顆粒會在愈傷組織的培養過程中逐漸消失。說明病毒顆粒會在愈傷組織的培養過程中逐漸消失。愈傷組織脫病毒的機理愈傷組織脫病毒的機理 可

23、能的原因有：可能的原因有：病毒在植物體內不同器官或同一器官的不同組織病毒在植物體內不同器官或同一器官的不同組織中分布不均勻，由那些無病毒細胞增殖產生的愈中分布不均勻，由那些無病毒細胞增殖產生的愈傷組織就是獲得無病毒苗的基礎。傷組織就是獲得無病毒苗的基礎。有些愈傷組織細胞中病毒濃度較低，在愈傷組織有些愈傷組織細胞中病毒濃度較低，在愈傷組織細胞快速分裂過程中，病毒的復制能力衰退或丟細胞快速分裂過程中，病毒的復制能力衰退或丟失。失。繼代培養的愈傷組織容易產生抗性變異細胞，因繼代培養的愈傷組織容易產生抗性變異細胞，因而可能出現不帶病毒的愈傷組織。但經愈傷組織而可能出現不帶病毒的愈傷組織。但經愈傷組織產

24、生無病毒苗的脫毒途徑容易產生變異，可能導產生無病毒苗的脫毒途徑容易產生變異，可能導致植株喪失其原有的優良性狀，當然也有可能產致植株喪失其原有的優良性狀，當然也有可能產生有益的變異，但頻率極低。生有益的變異，但頻率極低。3.莖尖微體嫁接脫毒莖尖微體嫁接脫毒先將砧木種子進行表面消毒，以后再接到先將砧木種子進行表面消毒，以后再接到1%瓊脂以瓊脂以MS無機無機鹽培養基培養發芽，用苗齡約鹽培養基培養發芽，用苗齡約2周的幼嫩實生苗作砧木。周的幼嫩實生苗作砧木。把實生苗從試管中取出，在無菌條件下切去頂部，留下把實生苗從試管中取出，在無菌條件下切去頂部，留下1-1.5cm的上胚軸部分，將子葉和腋芽除去，把根切

25、短至的上胚軸部分，將子葉和腋芽除去，把根切短至46cm長。長。從田間或溫室旺盛生長的成年樹剪取一小段新梢，經消毒后從田間或溫室旺盛生長的成年樹剪取一小段新梢，經消毒后在超凈臺上用顯微操作法取出僅帶在超凈臺上用顯微操作法取出僅帶1-3個葉原基的莖尖約個葉原基的莖尖約1mm大小作穗用。采用倒大小作穗用。采用倒T字形的水平切口。字形的水平切口。嫁接苗用液體濾紙橋培養基培養。成活率嫁接苗用液體濾紙橋培養基培養。成活率30%50%，嫁接，嫁接成功的植株移植到土壤之前至少要有兩片展開的真葉。成功的植株移植到土壤之前至少要有兩片展開的真葉。 蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率蘋

26、果不同取材時期對微體嫁接成功率的影響蘋果不同取材時期對微體嫁接成功率的影響試管微體嫁接在果樹方面發展最快 (1)嫁接植物不受與珠心及有性實生苗相關的幼年階段的嫁接植物不受與珠心及有性實生苗相關的幼年階段的影響。影響。(2)許多栽培品種通過嫁接繁殖了許多世代，因此果樹研許多栽培品種通過嫁接繁殖了許多世代，因此果樹研究者和種植者關于這些品種的自根苗的根冠大小、病蟲究者和種植者關于這些品種的自根苗的根冠大小、病蟲害情況以及耐寒性等了解得很少。害情況以及耐寒性等了解得很少。(3)莖尖組織培養繁殖結合熱處理可產生無莖尖組織培養繁殖結合熱處理可產生無病毒植物，因此，許多研究者認為對通病毒植物，因此，許多研

27、究者認為對通常采用嫁接繁殖的果樹進行試管嫁接是常采用嫁接繁殖的果樹進行試管嫁接是很適宜的。很適宜的。(4)試管微體嫁接除了可培育無病毒植株外，試管微體嫁接除了可培育無病毒植株外，還可解決難以生根的園藝植物的生根問還可解決難以生根的園藝植物的生根問題和進行嫁接親和力的研究。題和進行嫁接親和力的研究。4.珠心胚培養脫毒珠心胚培養脫毒 柑桔類柑桔類80%以上的種類具有多胚性以上的種類具有多胚性,而單胚占的比例很小。而單胚占的比例很小。 柑橘類植物中有不少多胚品種，一顆種子內除一個合子胚外，還有數柑橘類植物中有不少多胚品種，一顆種子內除一個合子胚外，還有數個至數十個由珠心細胞形成的無性胚，稱做個至數十

28、個由珠心細胞形成的無性胚，稱做珠心胚。珠心胚。因為因為病毒通常是經維管束的韌皮組織傳播病毒通常是經維管束的韌皮組織傳播的，而珠心與維管束系統無直的，而珠心與維管束系統無直接聯系。由珠心組織誘導產生的植株就可免除病毒的危害。接聯系。由珠心組織誘導產生的植株就可免除病毒的危害。它與合子胚不同，不是受精的產物，而是由體它與合子胚不同，不是受精的產物，而是由體細胞產生的，因此具有和母體相同的遺傳組成；細胞產生的，因此具有和母體相同的遺傳組成；與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無維管組與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無維管組織連系，因此即使母體植株感染了病毒，珠心織連系，因此即使母體植株感染了病毒，珠心胚

29、也是無毒的；胚也是無毒的；在自然條件下，珠心胚一般都不能發育成熟，在自然條件下，珠心胚一般都不能發育成熟，只有適時從種子中剝離出來，接種在人工培養只有適時從種子中剝離出來，接種在人工培養基上，珠心胚才能長成植株，而這些植株應當基上，珠心胚才能長成植株，而這些植株應當是不帶病毒的母體無性系。是不帶病毒的母體無性系。珠心胚具有珠心胚具有3個特征個特征5.花藥培養脫毒花藥培養脫毒花藥培養的最初目的，是培育起源于花藥內部花粉花藥培養的最初目的，是培育起源于花藥內部花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來源。料的來源。但經大量實驗表明花藥培養所得的植

30、株有但經大量實驗表明花藥培養所得的植株有95%以上以上是能開花結果的多倍體，而且生長發育都優于母是能開花結果的多倍體，而且生長發育都優于母株。株。已證明，經愈傷組織培養出來的花藥植株是不帶病已證明，經愈傷組織培養出來的花藥植株是不帶病毒的，借此方法，不僅可快速培育出大量的無毒毒的，借此方法，不僅可快速培育出大量的無毒植株，并可省去病毒鑒定工作，對基層生產應用植株，并可省去病毒鑒定工作，對基層生產應用實為一舉兩得的事情。實為一舉兩得的事情。三、分離莖尖的培養情況三、分離莖尖的培養情況第一種：第一種：是生長停止是生長停止，接種的組織擴大，顏色逐漸變褐而枯死，接種的組織擴大，顏色逐漸變褐而枯死，這種

31、情況大多是生這種情況大多是生長點在分離接種過程中受傷長點在分離接種過程中受傷而造成的；而造成的；第二種：第二種：是生長太慢是生長太慢，莖尖接種后顏色逐漸變綠，但不見增大，莖尖接種后顏色逐漸變綠，但不見增大，最后成綠色小點。這是由于最后成綠色小點。這是由于生長素濃度偏低，或培養溫度過低生長素濃度偏低，或培養溫度過低所造成的，如果立即轉入較高濃度生長素的培養基中，或提高所造成的，如果立即轉入較高濃度生長素的培養基中，或提高培養溫度，即能促進莖尖生長；培養溫度，即能促進莖尖生長；第三種：第三種：是生長過旺是生長過旺，接種后莖尖明顯增大，約培養一同后即在莖，接種后莖尖明顯增大，約培養一同后即在莖尖基部

32、產生愈傷組織，但不易見到莖尖的伸長，組織顏色也較淺。尖基部產生愈傷組織，但不易見到莖尖的伸長，組織顏色也較淺。這是由于培養莖這是由于培養莖生長素濃度偏高，或光照弱，溫度高生長素濃度偏高，或光照弱，溫度高而造成的。而造成的。為此應將培養材料轉入生長素濃度較低的培養基中，或降低溫度，為此應將培養材料轉入生長素濃度較低的培養基中，或降低溫度，提高光照強度來解決。否則時間長了愈傷組織會表現生長分化能提高光照強度來解決。否則時間長了愈傷組織會表現生長分化能力；力；第四種：第四種：是生長正常是生長正常、在營養、激素、溫度、光照等各方面條件正、在營養、激素、溫度、光照等各方面條件正常的情況下，接種的莖尖顏色

33、逐漸變綠，基部逐漸增大，有時形常的情況下，接種的莖尖顏色逐漸變綠，基部逐漸增大，有時形成少量的愈傷組織，莖尖也逐漸伸長，培養一個月左右轉入無基成少量的愈傷組織，莖尖也逐漸伸長，培養一個月左右轉入無基素的基本培養基，莖尖繼續伸長，并產生根系，最后發育成完整素的基本培養基，莖尖繼續伸長，并產生根系，最后發育成完整植株。植株。第三節第三節 無病毒植株脫毒程序無病毒植株脫毒程序一、材料準備一、材料準備1選擇植物種類及品種。選用生長健壯，遺傳性一致的品種為材選擇植物種類及品種。選用生長健壯，遺傳性一致的品種為材料，并探明該品種所脫除料，并探明該品種所脫除 的病毒在寄主中的位置。的病毒在寄主中的位置。2了

34、解該植物體內所具有的病毒種類及危害的程了解該植物體內所具有的病毒種類及危害的程 度。根據植物度。根據植物所帶病毒種類，選擇指示植物所帶病毒種類，選擇指示植物(敏感植物敏感植物)。3決定脫除病毒的方法：決定脫除病毒的方法：“莖尖培養莖尖培養”還是還是“熱處理熱處理”還是還是“微微體嫁接體嫁接”。二、生長點分離和培養二、生長點分離和培養(莖尖培養為例莖尖培養為例)1從罹病的植株上切取頂芽或腋芽。從罹病的植株上切取頂芽或腋芽。2材料表面滅菌、決定滅菌藥劑、濃度、時間。材料表面滅菌、決定滅菌藥劑、濃度、時間。3根據病毒在寄主內分布位置決定切取莖尖大小。如果熱根據病毒在寄主內分布位置決定切取莖尖大小。如

35、果熱處理，那么決定熱處理的溫度、時間。處理，那么決定熱處理的溫度、時間。4接種成功率與莖形狀結構有關。接種成功率與莖形狀結構有關。例例 馬鈴薯、百合生長點呈半圓形，較大、好分離。馬鈴薯、百合生長點呈半圓形，較大、好分離。 番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比較好分離。番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比較好分離。 大麗花、菊花生長點扁平、被對生葉原基夾住難分離。大麗花、菊花生長點扁平、被對生葉原基夾住難分離。 草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長點埋在肉質凹形槽草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長點埋在肉質凹形槽 內，不僅難分離且容易污染。內，不僅難分離且容易污染。三、無病毒植物的鑒定三、無病毒植物的鑒定

36、通過莖尖分生組織培養、熱處理脫毒法、微體嫁接法而培養成的通過莖尖分生組織培養、熱處理脫毒法、微體嫁接法而培養成的植株，不一定都是無病毒植株。植株，不一定都是無病毒植株。當前用于病毒檢測的方法有如下當前用于病毒檢測的方法有如下3種：種：血清鑒定法；血清鑒定法；生物鑒定法生物鑒定法(敏感植物或指示植物敏感植物或指示植物)；電子顯微鏡鑒定法。電子顯微鏡鑒定法。采用單一鑒定法并不十分可靠。特別是對一些特異性病毒，單一采用單一鑒定法并不十分可靠。特別是對一些特異性病毒，單一鑒定方法可靠性更差。最好三種方法同時鑒定，可以獲得理想鑒定方法可靠性更差。最好三種方法同時鑒定，可以獲得理想的結果。的結果。(一一)

37、指示植物鑒定法指示植物鑒定法1、原理、原理 指示植物法是利用病毒在其它植物上產生的指示植物法是利用病毒在其它植物上產生的枯斑作為病毒種類鑒別的標準，也即枯斑和枯斑作為病毒種類鑒別的標準，也即枯斑和空斑測定法。空斑測定法。2、指示植物兩種類型、指示植物兩種類型一種是接種后產生系統性癥狀，擴展到植物非接種部位，通一種是接種后產生系統性癥狀，擴展到植物非接種部位，通常沒有局部明顯病斑；常沒有局部明顯病斑；另一種是只產生局部病斑，常由壞死、褪綠或環斑構成。另一種是只產生局部病斑，常由壞死、褪綠或環斑構成。常用的指示植物：常用的指示植物：千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、辣椒、千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、

38、辣椒、莨菪等莨菪等。 每種病毒都有自己的敏感植物如：每種病毒都有自己的敏感植物如：馬鈴薯病毒的敏感植物：馬鈴薯病毒的敏感植物：千日紅、黃花煙、心葉千日紅、黃花煙、心葉煙、煙、 毛葉曼陀羅；毛葉曼陀羅；大蒜病毒的敏感植物：大蒜病毒的敏感植物：藜、千日紅；藜、千日紅；草莓病毒的敏感植物：草莓病毒的敏感植物：威州草莓威州草莓(從八倍體野生種從八倍體野生種選出選出)、野草莓、野紅草莓野草莓、野紅草莓等。等。桃紅葉病毒的敏感植物：桃紅葉病毒的敏感植物：旱金蓮旱金蓮。大麗花病毒的敏感植物：大麗花病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜、心昆落阿藜、莧色藜、心葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛、黃瓜。葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛

39、、黃瓜。香石竹病毒的敏感植物：香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜昆落阿藜、莧色藜。菊花病毒的敏感植物：矮牽牛、豇豆。菊花病毒的敏感植物：矮牽牛、豇豆。3、敏感植物鑒定病毒的方法：敏感植物鑒定病毒的方法： A、摩擦接種法：、摩擦接種法：取培養植株的葉片榨汁，將其汁用摩擦法接種到各自的取培養植株的葉片榨汁，將其汁用摩擦法接種到各自的敏感植物上，然后視其病斑有無，來判斷是否脫除了病敏感植物上，然后視其病斑有無，來判斷是否脫除了病毒。毒。接種后如若敏感植物葉片表現病斑，可根據病斑類型判接種后如若敏感植物葉片表現病斑，可根據病斑類型判斷，還有哪種病毒沒有脫除。斷，還有哪種病毒沒有脫除。 例：馬鈴薯體

40、內各種病毒在其敏感植物上表現的癥狀例：馬鈴薯體內各種病毒在其敏感植物上表現的癥狀：X病毒侵染千日紅病毒侵染千日紅(葉片呈枯斑葉片呈枯斑)；M、S病毒侵染千日紅病毒侵染千日紅(葉片呈突起枯斑葉片呈突起枯斑)；X病毒侵染黃花煙病毒侵染黃花煙(葉片呈花葉葉片呈花葉)；Y病毒侵染黃花煙病毒侵染黃花煙(葉片花葉或條斑或呈明顯脈綠帶葉片花葉或條斑或呈明顯脈綠帶)；X病毒侵染心葉煙病毒侵染心葉煙(葉片呈花葉葉片呈花葉)；Y病毒侵染心葉煙病毒侵染心葉煙(葉片呈條斑葉片呈條斑)；PG帶毒體侵染心葉煙帶毒體侵染心葉煙(葉片呈葉片呈花葉花葉)；M、Y病毒侵染毛葉曼陀羅病毒侵染毛葉曼陀羅(葉片呈枯斑葉片呈枯斑)。植物

41、汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，使黃花煙、心葉植物汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，使黃花煙、心葉煙葉片呈花葉證明，該植物體內具有馬鈴薯煙葉片呈花葉證明，該植物體內具有馬鈴薯X病毒。病毒。B嫁接法：嫁接法：有些病毒有些病毒不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體傳播傳播。如草莓黃化病毒、草莓叢枝病毒是通過一。如草莓黃化病毒、草莓叢枝病毒是通過一種特殊的蚜蟲為介體進行傳播。種特殊的蚜蟲為介體進行傳播。這種病毒的鑒定，需將培養植株的芽嫁接在敏感植這種病毒的鑒定，需將培養植株的芽嫁接在敏感植物上，根據敏感植物的病癥表現來判斷是否脫除物上，根據敏感植物的病癥表

42、現來判斷是否脫除了病毒。了病毒。木本多年生植物及草莓等無性繁殖的草本植物通常采用木本多年生植物及草莓等無性繁殖的草本植物通常采用嫁接接種的方法嫁接接種的方法以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法為多。接等方法嫁接，其中以劈接法為多。如草莓以對病毒敏感的歐洲草莓（野草莓）和深紅莓作指示植物，如草莓以對病毒敏感的歐洲草莓（野草莓）和深紅莓作指示植物，從經脫毒得到的植株上僅取頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削從經脫毒得到的植株上僅取頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削成楔形，削面長成楔形，削面長810 mm，然

43、后迅速將接穗小葉的葉柄插入切，然后迅速將接穗小葉的葉柄插入切口，用塑料綁縛接合部，嫁接后口，用塑料綁縛接合部，嫁接后4周，若帶有病毒，則在新展開周，若帶有病毒，則在新展開的葉片、匍匐莖或老葉上會出現病征的葉片、匍匐莖或老葉上會出現病征 （二）抗血清鑒定法二）抗血清鑒定法1、基本原理：基本原理： 當動物被病毒感染或人工注射異體蛋白質當動物被病毒感染或人工注射異體蛋白質時，在動物體內會產生一種特異性丙種球時，在動物體內會產生一種特異性丙種球蛋白稱為免疫球蛋白，即所謂蛋白稱為免疫球蛋白，即所謂“抗體抗體”。 引起形成抗體的物質引起形成抗體的物質(病毒或異體蛋白病毒或異體蛋白)稱稱為為“抗原抗原”。

44、抗原和抗體結合，表現為很強的特抗原和抗體結合，表現為很強的特異性。即由一種病毒產生的抗體，異性。即由一種病毒產生的抗體，只能結合該種病毒。抗體在特殊細只能結合該種病毒。抗體在特殊細胞內形成，進入血液存在于血清和胞內形成，進入血液存在于血清和體液內。體液內。 這種含有特異性這種含有特異性“抗體抗體”的血清稱的血清稱為為“抗血清抗血清”。抗原和抗體相結合抗原和抗體相結合的反應稱為的反應稱為“血清反應血清反應”。2.病毒抗血清在診斷上的價值病毒抗血清在診斷上的價值A.病毒抗血清具有高度的專化性。即由一種病毒產生的病毒抗血清具有高度的專化性。即由一種病毒產生的“抗體抗體”，只能結合該種病毒只能結合該種

45、病毒(抗原抗原)。如由注射。如由注射(感染感染)TMV而產生的抗體而產生的抗體(免疫球蛋白免疫球蛋白)，只能檢測，只能檢測TMV病毒病毒(才可能發生血清反應才可能發生血清反應)。B由于由于“抗血清抗血清”法具有高度專化性，因此對于那些受感染而法具有高度專化性，因此對于那些受感染而沒有癥狀的帶毒植物，也能診斷，故在實用上具有很高的價值。沒有癥狀的帶毒植物，也能診斷，故在實用上具有很高的價值。C由于病毒與由于病毒與“抗血清抗血清”的的“反應量反應量”與病毒濃度成正比。只與病毒濃度成正比。只要知道其中一種濃度，可根據反應量來測定另一種的濃度。故要知道其中一種濃度，可根據反應量來測定另一種的濃度。故此

46、可以用來作病毒的定量分析。此可以用來作病毒的定量分析。3.病毒抗血清在診斷上的局限性：病毒抗血清在診斷上的局限性：A.不是所有病毒都能制成抗血清，一般不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黃化型黃化型”病毒，或嚴格病毒，或嚴格由專化性昆蟲傳播的病毒。如馬鈴薯卷葉病毒極難或不能獲得由專化性昆蟲傳播的病毒。如馬鈴薯卷葉病毒極難或不能獲得“抗血清抗血清”。B病毒在寄主體內含量太少，而提純過程中喪失又太多。或者病毒在寄主體內含量太少，而提純過程中喪失又太多。或者提純過程中，病毒質粒喪失了必備的抗原結構。提純過程中，病毒質粒喪失了必備的抗原結構。C植物體內具有單寧物質，單寧與病毒結合，使病毒喪失了抗植物體內

47、具有單寧物質，單寧與病毒結合，使病毒喪失了抗原性質。原性質。4、方法、方法 抗血清鑒定首先要進行抗原的制備，包括病毒的繁殖、病葉抗血清鑒定首先要進行抗原的制備，包括病毒的繁殖、病葉研磨、汁液的澄清、病毒懸浮液的提純、病毒的沉淀等過程。研磨、汁液的澄清、病毒懸浮液的提純、病毒的沉淀等過程。只有獲得高純度的抗原，才有可能獲得高度純凈的抗血清。只有獲得高純度的抗原，才有可能獲得高度純凈的抗血清。一般采用家兔制備抗植物病毒的抗血清，以一般采用家兔制備抗植物病毒的抗血清，以924個月大小的家個月大小的家兔為好，注射病毒懸浮液，在家兔饑餓兔為好，注射病毒懸浮液，在家兔饑餓12 h后采血，再進行后采血，再進

48、行抗血清的分離和吸收等過程。血清可分裝在小玻璃瓶中，貯抗血清的分離和吸收等過程。血清可分裝在小玻璃瓶中，貯存在存在1520 的冰凍條件下，也可以分裝在安瓶中，冷的冰凍條件下，也可以分裝在安瓶中，冷凍干燥，然后密封，有效保存。凍干燥，然后密封，有效保存。 具體測定可采用沉淀反應、凝集反應、免疫擴散、免疫具體測定可采用沉淀反應、凝集反應、免疫擴散、免疫電泳、熒光抗體技術和酶聯免疫吸附試驗等多種方法。電泳、熒光抗體技術和酶聯免疫吸附試驗等多種方法。酶聯免疫吸附法酶聯免疫吸附法 (enzyme 1inked immunosorbent assay，EL工SA) 酶聯免疫吸附法是把抗原酶聯免疫吸附法是把

49、抗原抗體的免疫反應與酶的催化反應抗體的免疫反應與酶的催化反應相互結合而發展起來的一種綜合性技術，相互結合而發展起來的一種綜合性技術，它的靈敏度高，特它的靈敏度高，特異性強，異性強，特別是當寄主體內病毒濃度很低或同時存在病毒鈍特別是當寄主體內病毒濃度很低或同時存在病毒鈍化物或抑制劑時，它的優勢尤為明顯，因而是近年來病毒檢化物或抑制劑時，它的優勢尤為明顯，因而是近年來病毒檢測方法中發展最快、應用最廣的一種方法。測方法中發展最快、應用最廣的一種方法。 酶聯免疫吸附法的原理酶聯免疫吸附法的原理 利用以酶標記的特異抗體來指示抗原利用以酶標記的特異抗體來指示抗原抗體的結合，從而檢出抗體的結合，從而檢出樣品

50、中的抗原。樣品中的抗原。 具體操作程序是：具體操作程序是：將待檢植物汁液將待檢植物汁液(抗原抗原)注入酶聯板注入酶聯板(聚苯乙烯多孔微量反聚苯乙烯多孔微量反應板應板)中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以酶標記的特異抗體，酶標記的特異抗體，待抗待抗原與抗體充分反應后，洗去未與抗原結合的多余酶標記抗體，于是在固相原與抗體充分反應后，洗去未與抗原結合的多余酶標記抗體，于是在固相載體酶聯板表面就只留下以酶標記的抗原載體酶聯板表面就只留下以酶標記的抗原抗體復合物。這時加入酶的無抗體復合物。這時加入酶的無色底物，復合物上的酶催化底物降解，生成有色產物。這一結果可用肉眼色

51、底物，復合物上的酶催化底物降解，生成有色產物。這一結果可用肉眼識別，也可用分光光度計對底物的降解量進行測定。識別，也可用分光光度計對底物的降解量進行測定。血清鑒定血清鑒定法法血清鑒定的基本方法血清鑒定的基本方法 A.玻璃片凝集法玻璃片凝集法 在清潔玻璃片的一端，用毛細管滴加在清潔玻璃片的一端，用毛細管滴加5滴稀滴稀“抗血清抗血清”，另一端滴加等量對照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出另一端滴加等量對照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出的原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置的原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在然后在40-60倍顯微鏡下觀察。帶病毒的葉綠體發生典倍顯微鏡下觀察

52、。帶病毒的葉綠體發生典型的凝集現象。型的凝集現象。玻璃片玻璃片凝集法凝集法 B微量凝集試驗微量凝集試驗(MAT) 在培養皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙烯醇縮甲醛在培養皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙烯醇縮甲醛薄膜，然后將抗血清、提取汁液滴入薄膜上，再在薄膜，然后將抗血清、提取汁液滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆蓋一層石蠟油。在血清液滴上方覆蓋一層石蠟油。在2025下保溫，下保溫，20-50min后觀察。后觀察。 此法優點：此法優點：鑒定時可以完全避免蒸發，抗血清用量鑒定時可以完全避免蒸發，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加少，每毫升抗血清可滴加150次，每培養皿可以鑒定次，每培養皿可以鑒定幾十個樣品。對

53、某些病毒幾十個樣品。對某些病毒(馬鈴薯馬鈴薯M病毒病毒)引起的細微引起的細微病毒凝聚現象均可識別。病毒凝聚現象均可識別。 （三）電子顯微鏡檢查法（三）電子顯微鏡檢查法采用電子顯微鏡，可以通過直接觀察，檢查出有無病毒存在，并采用電子顯微鏡，可以通過直接觀察，檢查出有無病毒存在，并可以得知有關病毒顆粒的大小、形狀和結構可以得知有關病毒顆粒的大小、形狀和結構,又可以鑒定病毒又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進的方法，但需一定的設備和技術。的種類。這是一種較為先進的方法，但需一定的設備和技術。 病毒病毒 形態形態 長長(nm) 寬（寬（nm） X 線線 狀狀 515 13 Y 線線 狀狀 730 1

54、1 A 線線 狀狀 730 11 S 線線 狀狀 650 1213 M 線線 狀狀 650 1213 靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測定病毒。靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測定病毒。 目前運用負染和超薄切片電鏡觀察能夠診斷和鑒目前運用負染和超薄切片電鏡觀察能夠診斷和鑒別病毒到屬的水平。別病毒到屬的水平。 1973年，年，Derrick把電鏡與免疫學技術相結合，建把電鏡與免疫學技術相結合，建立了更為靈敏的免疫吸附電鏡技術，該技術已成立了更為靈敏的免疫吸附電鏡技術，該技術已成為植物病毒研究的一個重要手段。為植物病毒研究的一個重要手段。方法的優點方法的優點(四四)分子生物學方法分子生物學方法在植

55、物病毒鑒定中采用的分子生物學方法主要是檢測病毒的核在植物病毒鑒定中采用的分子生物學方法主要是檢測病毒的核酸。酸。一般都具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強等特點。一般都具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強等特點。核酸雜交技術的原理核酸雜交技術的原理:采用帶有放射性或非放射性物質標記的已采用帶有放射性或非放射性物質標記的已知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒的核酸單知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。通過雜交信號的檢測，鑒定樣本中有鏈退火形成雜交雙鏈。通過雜交信號的檢測，鑒定樣本中有無相應病毒的基因。無相應病毒的基因。 19世紀末以來，許多國家開始用聚合酶

56、鏈式反應世紀末以來，許多國家開始用聚合酶鏈式反應(PCR)技術檢測果樹病技術檢測果樹病毒，并取得很好的效果。毒，并取得很好的效果。 常用的有聚合酶鏈式反應常用的有聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術，技術，即利即利用已知病毒的核苷酸序列或同組病毒的相似序列區域來設計引物，將待用已知病毒的核苷酸序列或同組病毒的相似序列區域來設計引物，將待測樣品用測樣品用PCR技術體外擴增技術體外擴增DNA，擴增后的產物可進行限制性片段長度，擴增后的產物可進行限制性片段長度多態性多態性(restriction fragment length polymorphism，R

57、FLP)、隨機擴增多、隨機擴增多態性態性DNA(random amplified polymorphic DNA RAPD)、擴增片段長度、擴增片段長度多態性多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、變性梯度凝、變性梯度凝膠電泳膠電泳(denaturing grade gel electrophoresis，DGGE)、單鏈構象多態性、單鏈構象多態性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)、探針交叉雜交等技、探針交叉雜交等技術分析檢測病毒是否存在。術分析檢測病毒是否存在。 由于多數植物病

58、毒核酸是由于多數植物病毒核酸是RNA，在進行，在進行PCR檢測前，檢測前，需以需以RNA為模板，經逆轉錄生成為模板，經逆轉錄生成cDNA后，再利用病毒核酸后，再利用病毒核酸特有的序列設計的引物進行特有的序列設計的引物進行PCR反應，即可知道在寄主中反應，即可知道在寄主中是否有病毒存在。是否有病毒存在。 RNA病毒和類病毒等在寄主體內可形成雙鏈病毒和類病毒等在寄主體內可形成雙鏈RNA(dsRNA)，而一般情況下植物體內不存在，而一般情況下植物體內不存在dsRNA，因，因此此dsRNA分析也可用于植物病毒鑒定。分析也可用于植物病毒鑒定。 利用利用DNA雜交和熒光標記技術相結合的基因芯片雜交和熒光標

59、記技術相結合的基因芯片技術也是植物病毒快速檢測的重要發展方向。技術也是植物病毒快速檢測的重要發展方向。 在實際應用中，為了提高檢測的可靠性，往往用在實際應用中，為了提高檢測的可靠性，往往用幾種方法同時鑒定。最后選擇出的無毒苗即可進行幾種方法同時鑒定。最后選擇出的無毒苗即可進行擴增繁殖，用于生產。但在無毒種苗的擴增繁殖和擴增繁殖，用于生產。但在無毒種苗的擴增繁殖和應用過程中應注意防止再度感染。應用過程中應注意防止再度感染。植物脫毒苗生產應用尚不普遍，原因如下：植物脫毒苗生產應用尚不普遍，原因如下：基礎研究跟不上，諸如病毒特性與寄主的基礎研究跟不上，諸如病毒特性與寄主的關系，各植物體內都有什么病毒等。關系，各植物體內都有什么病毒等。脫毒培養后如何快速檢測。脫毒培養后如何快速檢測。得到脫毒原種苗后，如何保存得到脫毒原種苗后，如何保存?如何防止如何防止再度侵染等。再度侵染等。四、無毒原種苗的繁殖四、無毒原種苗的繁殖 經莖尖培養法，熱處理法、微體嫁接法獲得的無病毒經莖尖培養法，熱處理法、微體嫁接法獲得的無病毒株數量是很有限的，需擴大繁殖才能滿足生產需要。株數量是很有限的，需擴大繁殖才能滿足生產需要。 一方面充分發揮組織培養作用，在室內加速繁殖；另一方面充分發揮組織培養作用，在室內加速繁殖；另一方面加