1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy匯報人：張杰2015年3月16日基本介紹基本介紹 中文名稱：中文名稱： 激光掃描共聚焦顯微鏡 英文名稱：英文名稱： Confocal Laser Scanning Microscopy;CLSM 定義：定義： 利用激光點作為熒光的激發(fā)光并通過掃描裝置對標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)掃描，并通過空間共軛光闌（針孔）阻擋離焦平面光線而成像的一種顯微鏡。是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。 應(yīng)用學(xué)科：應(yīng)用學(xué)科： 細(xì)胞生物學(xué)（一

2、級學(xué)科）；細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)（二級學(xué)科）共聚焦顯微鏡的原理簡介（ Confocal Laser Scan Microscope CLSM） 從某種意義上講，共聚焦顯微鏡從某種意義上講，共聚焦顯微鏡是一種現(xiàn)代化的光學(xué)顯微鏡，它對傳是一種現(xiàn)代化的光學(xué)顯微鏡，它對傳統(tǒng)的光鏡從以下幾方面作了改進(jìn)統(tǒng)的光鏡從以下幾方面作了改進(jìn) 在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源激光光源，掃掃描裝置描裝置，共扼聚焦裝置共扼聚焦裝置和檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)而形成的新型顯微鏡。 利用共聚焦光路和激光掃描獲得生物樣品的顯微斷層圖象，動態(tài)掃描記錄、圖像處理及三維立體構(gòu)建、成份分析等軟件。原理簡介原理簡介激光器光電倍增管檢測器顯微鏡步近器計算機電子圖

3、像軟件激光器擴光器樣品濾光片針孔檢測器入射光發(fā)射光長通濾光片入射光發(fā)射光長通濾光片激光器擴光器樣品濾光片針孔檢測器入射光發(fā)射光長通濾光片激光器擴光器樣品濾光片針孔檢測器普通光學(xué)顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別普通光學(xué)顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別3、點與面掃描技術(shù) 共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點，用十分細(xì)小的激光束維空間上的無數(shù)點，用十分細(xì)小的激光束（點光源）（點光源）逐點逐行掃瞄、成像逐點逐行掃瞄、成像，通過計，通過計算機軟件組合，最后得到一個整體平面的算機軟件組合，最后得到一個整體平面的或立體的像。或立體的像。 普通光鏡：是在可見光源下一

4、次性成像。普通光鏡：是在可見光源下一次性成像。4 4、圖像信號及處理：、圖像信號及處理： 光電倍增管放大信號，計光電倍增管放大信號，計算機采集和處理光信號。算機采集和處理光信號。 計算機代替了人眼或照相計算機代替了人眼或照相機進(jìn)行觀察、攝像，得到的圖機進(jìn)行觀察、攝像，得到的圖象是數(shù)字化的，可以在電腦中象是數(shù)字化的，可以在電腦中進(jìn)行處理，再一次提高圖象的進(jìn)行處理，再一次提高圖象的清晰度。清晰度。共聚焦顯微鏡的應(yīng)用 高清晰成像 半定量熒光強度分析 熒光探針表達(dá)量測定 分層掃描 多種熒光標(biāo)記同時檢測 熒光標(biāo)記物絕對定量分析 擴展應(yīng)用高清晰成像 激光共聚焦顯微鏡因使用共扼光路使非焦平面的光線被抑制，減

5、少了成像的干擾，以及使用光色較純的激光，所以成像分辨率可達(dá)普通光學(xué)顯微鏡的1.4倍。 可以清晰的表現(xiàn)某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mm0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm0.25mm電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率：0.2nm0.2nm共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18mm0.18mm牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞 ，微管牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞 ，微管鼠成纖維細(xì)胞單克隆anti-tubulin標(biāo)記 檢測人類癌細(xì)胞表皮生長因子培養(yǎng)的293細(xì)胞綠色熒光蛋白培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞啞叮橙染色透射光掃描（DIC） 利用激光透射掃描成像，用特殊濾光片達(dá)到相差顯微鏡的效果，可獲得清晰的

6、具有立體感的圖片熒光表達(dá)量測定Sunil S et al., Extracellular polymeric substances and structural stabilityof aerobic granule, Water Research, 42(2008)16441650分層掃描（切片掃描）按共扼聚焦的原理，通過調(diào)節(jié)針孔的大小，可控制樣品掃描層面的厚度。即樣品中相當(dāng)薄的一層被探測到，而其他層面不影響成像。分層掃描（切片掃描）當(dāng)觀測較厚樣品時，普通透射光不能透過樣品，則可以通過切片掃描檢測熒光的方法來觀測。入射光被檢測層面整個樣品白光（不能透過）發(fā)射光分層掃描（切片掃描） 較厚層面

7、較薄層面人血管內(nèi)皮細(xì)胞PI標(biāo)記觀測損傷。標(biāo)記細(xì)胞為損傷細(xì)胞。分層掃描（切片掃描） 較厚層面 （平滑肌損傷可見） 較薄層面兔動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞PI標(biāo)記觀測損傷。標(biāo)記細(xì)胞為損傷細(xì)胞。分層掃描（切片掃描）連續(xù)分層掃描，可得到CT片類似的效果，對樣品Z軸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。經(jīng)計算機數(shù)據(jù)重組，可觀測空間結(jié)構(gòu)，空間定位，三維重組。利用專用圖象處理軟件圖象處理軟件，還可以實現(xiàn)其他許多數(shù)據(jù)分析。植物切片三維重建多色熒光標(biāo)記檢測普通熒光顯微鏡每次只能觀測一種熒光，要觀測多種熒光標(biāo)記的樣品需要多次觀測，對樣品損傷大。激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時掃描，多通道同時探測。Mouse 3T3 cells 紅色：ethi

8、dium homodimer1 ，染核綠色：BODIPY FL phallacidin，染肌絲蛋白牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞藍(lán)色：Hoechst 33342 染DNA紅色：PI，染核仁RNA綠色：Alexa Fluor 488染肌絲蛋白藤黃微球菌綠色：活菌紅色：死菌染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲繁殖吖叮橙染色綠色為DNA紅色為RNA激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在結(jié)構(gòu)方面在結(jié)構(gòu)方面激光做光源，光色純，波長固定，成像效果好，分辨率高，圖象清晰，熒光檢測信噪比高可實現(xiàn)分層掃描可實現(xiàn)連續(xù)掃描，可動態(tài)記錄變化可多根激光管同時掃描，多色熒光同

9、時成像掃描速度快，對樣品損傷小激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在應(yīng)用方面在應(yīng)用方面l形態(tài)觀察-高清晰成像l半定量-熒光強度分析l熒光探針表達(dá)量測定l定位研究-分層掃描l多種熒光標(biāo)記同時檢測l熒光標(biāo)記物絕對定量分析l擴展應(yīng)用-如，F(xiàn)RAP法、細(xì)胞切割、細(xì)胞篩選等激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在效果方面更靈敏： 共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術(shù)，可將很微弱共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術(shù)，可將很微弱的熒光信號放大。只要有信號就能被檢測到。的熒光信號放大。只要有信號就能被檢測到。定位更精確： 不僅可以定位到細(xì)胞水平，還可以定位到亞細(xì)胞不僅可以定位到細(xì)胞水平，還可以定位到亞細(xì)胞水平、和分子水平。這也是熒光標(biāo)記的抗體被稱為水

10、平、和分子水平。這也是熒光標(biāo)記的抗體被稱為分子探針的原因分子探針的原因定量測量： 靜態(tài)的定量測量靜態(tài)的定量測量 對于不同組的樣品，可以單純比較一種成分，也可以同時比較兩種甚至三種成分。也可以在同一張切片上比較不同成分含量。 動態(tài)的定量測量動態(tài)的定量測量 共聚焦顯微鏡還能對活細(xì)胞內(nèi)的特定成分活細(xì)胞內(nèi)的特定成分（如：鈣、鈉、氫等）進(jìn)行動態(tài)變化測量，并給出動態(tài)變化曲線；還可以同時測量幾種成分，并給出含量比值。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在效果方面 快速性：快速性： 由于利用光源光束點掃描，檢測過程快，時間短，計算機精確控制激發(fā)光強度，光漂白和熒光淬滅作用很小。數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存：數(shù)據(jù)圖像可及時輸

11、出或長期儲存： 用計算機代替了普通的照相機，得到的圖像是數(shù)字化的，不存在暴光方面及膠卷沖洗方面的問題（如熒光太弱，無法暴光；或曝光過程中熒光淬滅等）；而且圖像可進(jìn)一步加工處理。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在效果方面 共聚焦顯微鏡應(yīng)用領(lǐng)域 （一）細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)：細(xì)胞骨架，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動性、受體，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等。 （二）生物化學(xué)：酶、核酸、熒光原位雜交、受體分析。 （三）藥理學(xué)：藥物對細(xì)胞的作用及其動力學(xué)分析。 （四）生理學(xué)：膜受體，離子通道，細(xì)胞內(nèi)離子含量、分布及其動態(tài)分析。共聚焦顯微鏡應(yīng)用領(lǐng)域 （五）遺傳學(xué)和胚胎學(xué)： 細(xì)胞生長、分化，細(xì)胞組織的三維結(jié)構(gòu)，染色體分析

12、，基因表達(dá)，基因診斷 （六）神經(jīng)生物學(xué)： 神經(jīng)組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)，神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運輸和傳遞，遞質(zhì)受體，離子內(nèi)外流。 （七）微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)： 細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)（表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)）； （八）病理學(xué)研究及病理學(xué)臨床診斷： 活檢標(biāo)本的快速診斷，腫瘤診斷，自身免疫性疾病的診斷，宮頸上皮細(xì)胞涂片診斷Bing-Jie Ni at al., Microbial and Physicochemical Characteristics of Compact Anaerobic Ammonium-Oxidizing Granules in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 76(2010) 26522656CLSM imaging of activated sludge A (2 days of anaerobic starvation at 4 1C) (a) and sludge B (5 days of anaerobic starvation at 41C) (b).C. Lopez et al., Evaluati