1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)實驗指導(dǎo)實驗一 組培室設(shè)備參觀及器皿的洗滌和滅菌一、目的要求1通過參觀，了解組織培養(yǎng)室的幾個主要組成部分和各部分應(yīng)有的基本設(shè)備以及有關(guān)儀器的用途與功能。2通過實際操作，學(xué)會洗滌劑的配制和各種器皿的清洗和滅菌方法。二、材料用具高壓滅菌鍋、烘箱、超凈工作臺、雙筒解剖鏡、酸度測定儀、空調(diào)機、控溫儀、百分之一與萬分之一天平、電爐、玻璃器皿（試管、三角瓶、移液管、漏斗、燒杯、容量瓶、試劑瓶、量筒酒精燈），以及鑷子、解剖刀、解剖針、手術(shù)剪，肥皂、洗衣粉、重鉻酸鉀、濃硫酸等。三、說明在進行各類具體的組培實驗前，首先了解組培室的結(jié)構(gòu)及主要設(shè)備的用途和性能是十分必要的，總體上的了解有利于以后各實

2、驗的進行以及正確的使用各種儀器和設(shè)備。植物組織培養(yǎng)是一項十分細致的工作，為了保證植物外植體不受污染，第一關(guān)就是要對各種器皿進行清洗和消毒，使它們保持無菌狀態(tài)，做這些工作同樣有一套科學(xué)的方法和需要熟練的技巧，因此每個學(xué)生必須學(xué)好這套基本功。四、方法和步驟首先在老師帶領(lǐng)下參觀組培室，并聽取講解，然后配制洗液，稱取工業(yè)用重鉻酸鉀40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制濃硫酸（或廢硫酸）配好的溶液呈紅色，鉻酸洗液是一種強氧化劑，去污能力強，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蠟等則用此液無效，鉻酸洗液可反復(fù)使用，直到溶液呈青褐色為止。此溶液腐蝕性強，洗滌時需注意。每人清洗部分玻璃器皿，方

3、法：清水洗凈泡入洗衣粉水溶液中進行洗刷清水反復(fù)沖洗蒸餾水淋一遍烘干備用 。然后清洗部分較臟的玻璃器皿，方法：采用先堿后酸，即用洗衣粉洗刷后沖洗干凈晾干侵入酪酸洗液，浸泡時間視器皿的骯臟程度而定清水反復(fù)沖洗干凈蒸餾水淋洗一遍烘干備用。帶有石蠟或膠布的器皿：先將其除去，再用常規(guī)洗滌，石蠟用水煮沸數(shù)次即可去掉，膠布粘著物則需用洗衣粉液煮沸數(shù)小時，再用水沖洗，涼干后浸入洗液，以后的步驟同前。對器皿和用具進行高壓滅菌，即用手提式高壓滅菌鍋，在1.2個大氣壓下保持1520分鐘。解剖刀、手術(shù)剪、解剖針、鑷子等用具 在接種前還要用百分之七十的酒精棉球擦一下，再用酒精燈的火焰滅菌，冷卻后即可應(yīng)用。五、作業(yè)試闡述

4、為什么要對器皿和用具進行嚴(yán)格的洗滌和滅菌？ 實驗二 MS培養(yǎng)基母液的制備及培養(yǎng)基的配制、滅菌一、 目的要求通過掌握培養(yǎng)基對母液制備及常用培養(yǎng)基的配制和滅菌方法，為植物組織培養(yǎng)準(zhǔn)備合適的營養(yǎng)條件。二、 材料用具高壓滅菌鍋、冰箱、普通及精密天平、電爐、鋁鍋、玻璃器皿（燒杯、量微、容量瓶、移液管、試劑瓶、三角瓶、漏斗），化學(xué)試劑(CaCl22H2O，KNO3，MgSO47H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2EDTA，F(xiàn)eSO47H2O，MgSO44H2O，Zn SO47H2O，H3BO3，KI，NaMoO42H2O，CuSO45H2O，CoCl26H2O，甘氨酸，鹽酸硫胺素，鹽酸吡哆醇，煙酸，

5、肌醇，蔗糖，瓊脂，若干種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及天然復(fù)合物，HCL，NaOH，酒精)，以及稱量紙、藥匙、玻璃棒、精密度紙，瓶蓋用紙，線繩或橡皮筋、鉛筆、標(biāo)簽紙。三、 說明植物材料培養(yǎng)要獲得成功，并正常生長，培養(yǎng)基的組成成分是一個決定性因素，不同植物要求不同的培養(yǎng)基，因此，在進行大量工作之前，對不同培養(yǎng)基應(yīng)進行分析、比較、試驗，選擇或發(fā)展出一個符合試驗材料需要的適宜培養(yǎng)基。大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機附加物等五類物質(zhì)組成。四、 方法和步驟1 培養(yǎng)基母液的制備母液的配制是按所使用藥品的類別，而分別配成大量元素、微量元素、維生素和鐵鹽等。配制母液時特別要注意無機

6、鹽成分在一起，可能產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，會產(chǎn)生硫酸鈣或磷酸鈣的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液貯存，應(yīng)分別配制和保存。表2.1 MS培養(yǎng)基母液的成份及配制成分1升培養(yǎng)基母液濃度（mg）1升培養(yǎng)基工作液濃度（mg）每升培養(yǎng)基取用量（ml）母液（大量元素）NH4NO3KNO3KH2PO4CaCl2.2H2OMgSO4.7H2O3300038000340088007400濃縮20倍1650190017044037050母液（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl

7、2.6H2O1661240446017205055濃縮200倍0.836.222.38.60.250.0250.0255母液（鐵鹽）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O55607460濃縮200倍27.837.35母液（有機成分）肌醇煙酸（VB5）鹽酸吡哆醇（VB6）鹽酸硫胺素（VB1）甘氨酸2000010010020400濃縮200倍1000.50.50.125配制母液時要用雙重蒸餾水等純度較高的水，藥品應(yīng)采用化學(xué)純或分析純級，藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確，各種藥品先以少量蒸餾水使其充分溶解，然后按培養(yǎng)基上的排列順序混合。現(xiàn)以Murashige和Skoog(1962)培養(yǎng)基為例敘述如下

8、：根據(jù)各種藥品的特點，母液可配成4種（見表2.1）。其中鐵鹽母液的配制方法是：將稱好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙猓缓髮煞N溶液混合，并將pH調(diào)至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標(biāo)簽，注明母液號、配制倍數(shù)、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。2植物激素的配制 一般將植物激素配制成0.11mg/ml的溶液，由于多數(shù)植物激素難溶于水，可采用以下方法配制： IAA、IBA：先溶于少量95%乙醇中，再加蒸餾水定容至需要濃度的體積。 NAA：可溶于熱水中或用少量95%乙醇或少量1m

9、ol/L的NaOH溶解后，再加蒸餾水定容至需要濃度的體積。 2，4-D:不溶于水，可用95%的乙醇溶解或用少量1mol/L的NaOH溶解后后，再加蒸餾水定容至需要濃度的體積。 KT及BA：先溶于少量的1mol/L HCl中，再加蒸餾水定容至需要濃度的體積。 GA3：赤霉素的水溶液穩(wěn)定性差，一般用95%的乙醇配制成510mg/ml的母液低溫保存，使用時再稀釋。以上配好的母液需貯存于24攝氏度的冰箱中，定期檢查有無沉淀或微生物的污染，如出現(xiàn)霉菌，渾濁或沉淀，則不可再用。以上各種混合液(母液)或單獨配制藥品，均應(yīng)放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱隨用。3培養(yǎng)基的配

10、制根據(jù)配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，以配制1000ml為例，按每升培養(yǎng)基要求含量/每ml母液含量=母液吸取量公式，分別吸取母液、母液、母液、母液各50ml、5ml、5ml、5ml及一定量的各種植物激素混合后，放入同一燒杯中，并用粗天平稱取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。將中稱好的瓊脂加蒸餾水300400毫升，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。將中所取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中，再加水至1000毫升，攪拌均勻，配成培養(yǎng)基。用1mol/L的氫氧化鈉或鹽酸，滴入中的培養(yǎng)基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用pH試紙測其pH值，直到將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5

11、.8。將配好的培養(yǎng)基，用漏斗分裝到三角瓶(或試管)中，并用棉塞塞緊瓶口，瓶壁寫上號碼。瓶中培養(yǎng)基的量約為容量的1/4或1/5，然后加棉塞，扎緊后滅菌。 培養(yǎng)基的成分比較復(fù)雜，為避免配制時忙亂而將一些成分漏掉，可以準(zhǔn)備一份配制培養(yǎng)基的成分單，將培養(yǎng)基的全部成分和用量填寫清楚。配制時，按表列內(nèi)容順序，按項按量稱取，就不會出現(xiàn)差錯。 4培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌法，即將分裝好的培養(yǎng)基放在高壓滅菌鍋中，加熱，待壓力上升到0.5kg/cm2時，打開放氣閥排凈冷空氣，關(guān)閉放氣閥繼續(xù)加熱使壓力穩(wěn)定在1.11.2kg/cm2，溫度為121攝氏度的條件下，維持1520分鐘，培養(yǎng)基滅菌時間不宜過長，以防

12、引起培養(yǎng)基成分的變化，也可采用間歇滅菌法進行滅菌，即將培養(yǎng)基煮沸10分鐘，24小時后再煮沸20分鐘，如此連續(xù)滅菌三次，即可達到完全滅菌的目的。經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)置于10下保存，特別是含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基，在45低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的一周內(nèi)使用完，其它培養(yǎng)基最多也不應(yīng)超過一個月。在多數(shù)情況下，應(yīng)在消毒后兩周內(nèi)用完。5.幾種常用培養(yǎng)基的配方MS培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基是目前普遍使用的培養(yǎng)基。它有較高的無機鹽濃度，對保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)和加速愈傷組織的生長十分有利。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存、消毒等過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響離子間的平

13、衡。MS固體培養(yǎng)基可用來誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)，它的液體培養(yǎng)基用于細胞懸浮培養(yǎng)時能獲得明顯成功。這種培養(yǎng)基中的無機養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細胞在營養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，無須再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機附加成分。與其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的明顯特點。其配方見表2.1。N6培養(yǎng)基（1974）N6培養(yǎng)基特別適合于禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng)，在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。在組織培養(yǎng)中，經(jīng)常采用的還有懷特（While，1963）培養(yǎng)基、尼許（Nitsch，1951）培養(yǎng)基等。它們在基本成分上

14、大同小異。懷特培養(yǎng)基由于無機鹽的數(shù)量比較低，更適合木本植物的組織培養(yǎng)。其配方如下（單位均為mg/l）：KNO3 2830(NH4)2SO4 463MgSO4*7H2O 185KH2PO4 400CaCL2*2H2O 166MnSO4*4H2O 4.4ZnSO4*7H2O 1.5H3BO3 1.6KI 0.8甘氨酸 2.0鹽酸硫胺素 1.0鹽酸吡哆素 0.5煙酸 0.5肌醇 100蔗糖 50000瓊脂 10000PH 5.8B5培養(yǎng)基（Gamborg等，1968）B5培養(yǎng)基的主要特點是含有較低的銨，這是因為銨可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，有些植物的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物在MS培養(yǎng)

15、基上生長得比B5培養(yǎng)基上要好，而另一些植物，在B5培養(yǎng)基上更適宜。其配方如下（單位均為mg/l）：NaH2PO4.H2O 150KNO3 3000(NH4)2SO4 134MgSO4.7H2O 500CaCL2.2H2O 150MnSO4. H2O 10H3BO3 3ZnSO4.7H2O 2Na2MOO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCL2.6H2O 0.025KI 0.75鹽酸硫胺素 10鹽酸吡哆素 1煙素 1肌醇 100蔗糖 20000瓊脂 10000PH 5.5五、 作業(yè)1 按上述方法配制MS培養(yǎng)基，先配母液，再配培養(yǎng)基，備用。2 制備母液時應(yīng)注意哪些問題？為什

16、么？實驗三 愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及分化一、 實驗?zāi)康?. 方面讓學(xué)生掌握組織培養(yǎng)相關(guān)的實驗操作以及科學(xué)實驗常用的正交實驗設(shè)計方法，了解植物組織培養(yǎng)的原理2. 另一方面也讓學(xué)生真實地感受現(xiàn)代生物技術(shù)與生產(chǎn)生活的聯(lián)系，體驗現(xiàn)代生物技術(shù)給人類生活帶來的變化。二、 實驗原理 植物體的根、莖、葉細胞一般都具有全能性，即每個細胞都有發(fā)育成完整植株的全部遺傳信息。在一定的營養(yǎng)和激素下，可以脫分化形成愈傷組織。三、 材料與方法 1. 植物材料 樹型金銀花2. 實驗設(shè)計 實驗技術(shù)路線外植體選取 外植體表面滅菌 誘導(dǎo)愈傷組織 篩選出最佳愈傷組織誘導(dǎo)配方 愈傷組織的增殖 為后備實驗打基礎(chǔ) 愈傷組織芽的分化 篩選出最

17、佳叢生芽分化培養(yǎng)基 生根培養(yǎng) 篩選出最佳生根培養(yǎng)基圖3.1 樹型金銀花快速繁殖技術(shù)路線圖試驗條件根據(jù)樹型金銀花的自然生態(tài)習(xí)性狀況，無特別說明，設(shè)定培養(yǎng)條件為溫度 251，16h光照/8h黑暗的光暗交替培養(yǎng)，光照強度1600Lx2000Lx。3. 試驗方案一（樹型金銀花） 植物的最佳繁殖方法，首先是由其遺傳特性所決定的，單就組織培養(yǎng)而言，它還受植物基因型、外植體種類、年齡、部位及培養(yǎng)基種類、激素類型及濃度和培養(yǎng)條件等諸因素的影響。本試驗在參考已有資料的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計和隨機區(qū)組試驗設(shè)計，注重培養(yǎng)基配方的研究(包括愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基類型、激素種類及濃度、激素

18、代用物等)，各階段設(shè)計方案如下:3.1 葉/芽/莖段愈傷組織的誘導(dǎo)本試驗以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基配方見表3.1。采用正交試驗設(shè)計探索生長調(diào)節(jié)因子6-BA、NAA對樹型金銀花幼嫩葉片誘導(dǎo)愈傷組織的適用量，每個處理重復(fù)5次，每重復(fù)接種20個外植體。 在超凈工作臺上將將頂芽接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+1.0mg / L6-BA+0.02 mg/L NAA+ 30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+pH 5. 8，121條件下滅菌30 min）上，先暗培養(yǎng)24 h，然后置于25 、光照1 000-1 500 lx條件下培養(yǎng)20天。表3.1 試驗采用2因素水平正交設(shè)計：不同激素種類及濃度對愈傷組織誘導(dǎo)

19、的影響處理6-BA mg/LNAA mg/L接種數(shù)量/個愈傷組織出現(xiàn)天數(shù)愈傷組織的形態(tài)、生長狀況產(chǎn)生愈傷組織數(shù)量/個愈傷組織誘導(dǎo)率/%1002020.50.012030.50.022040.50.052050.50.12061.00.012071.00.022081.00.052091.00.1203.2 愈傷組織叢生芽的誘導(dǎo)本試驗以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計探索生長調(diào)節(jié)因子6-BA，NAA對樹型金銀花愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)的適用量，6-BA、NAA均采用四種水平（表3.2）。每個處理重復(fù)5次，每重復(fù)接種10塊愈傷組織。 在超凈工作臺上將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代成芽培養(yǎng)基上（M

20、S +0. 5 mg/L 6-BA+1. 0mg / L NAA + 30 g / L蔗糖+ 8 g/L瓊脂，pH 5. 8 ，121條件下滅菌30 min） ，25天后繼續(xù)用成芽培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。表3.2不同激素種類及濃度對愈傷組織產(chǎn)生不定芽的影響處理6-BA /mg/LNAA /mg/L接種愈傷組織塊數(shù)/個不定芽產(chǎn)生時間/天不定芽產(chǎn)生數(shù)量/個10.50.011021.00.021032.00.051044.01.0103.3 生根培養(yǎng)本試驗以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基即將大量元素減半其它物質(zhì)配比不變的MS培養(yǎng)基。采用單因素試驗設(shè)計探索生長調(diào)節(jié)因子NAA對樹型金銀花叢生芽誘

21、導(dǎo)根分化的適用量，每培養(yǎng)皿接種10個外植體，每處理重復(fù)5次，實驗方案見表3.3。 將分化出來的長到2-3cm芽接種到生根培養(yǎng)基（1 /2MS+1.0mg / L NAA+200 mg/L活性炭+ 15 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+pH 5. 8，21條件下滅菌30 min）表3.3 不同濃度的NAA對組培苗成活率的影響濃度/mg/L生根數(shù)/株根長/cm成活率/%00.51.01.52.04實驗方法4.1 培養(yǎng)基的選擇 查閱的中文文獻和外文文獻中絕大多數(shù)金銀花的組培都選用MS（Murashige and Skoog,1962）培養(yǎng)基.它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而

22、設(shè)計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其它培養(yǎng)基為高，廣泛用于植物器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)。故選取MS培養(yǎng)基為樹型金銀花愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，以節(jié)約時間和減少浪費。但金銀花組培苗生根培養(yǎng)絕大多數(shù)采用1/2MS培養(yǎng)基 ,也有用1/4MS。本實驗采用1/2MS培養(yǎng)基。本試驗培養(yǎng)基中，30g/升 蔗糖， 8g/升 瓊脂，pH 5.8。4.2培養(yǎng)基的滅菌本實驗采用的培養(yǎng)基均為固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配制好后進行認真嚴(yán)格的高壓滅菌，滅菌條件為121C，約110Pa下滅菌20分鐘，滅菌完成后取出后適當(dāng)搖蕩使培養(yǎng)基里

23、面的瓊脂充分混勻，以防培養(yǎng)基凝固不好。待其冷卻凝固后使用。4.3 激素的選取根據(jù)外植體的不同分別選取了不同的激素，這些激素分別是:6-BA、NAA、2，4-D 、ZT、KT。4.4 外植體的選取 葉片 選取幼嫩葉片。 莖尖 采取新鮮的帶頂芽的莖段。4.5 外植體滅菌滅菌試劑的選取75%酒精，0.1%升汞，吐溫。將取回的金銀花枝條置于水槽中，用軟毛刷刷洗表面，自來水沖洗洗凈表面塵土，吸干外植體表面的水分,再將其剪成2 cm左右的帶腋芽的莖段,放入清洗液或洗衣粉溶液中浸泡15 min，自來水沖洗1 h，再用無菌水浸泡5 min，備用。 先用75%酒精浸泡20s，然后用無菌水清洗一次，倒去無菌水后，

24、再用0.1%升汞+1-2滴吐溫滅菌，滅菌過程中不斷搖動廣口瓶使外植體充分接觸滅菌劑，然后，倒出滅菌劑，用無菌水清洗外植體5-6次，直到外植體上沒有泡沫即可。4.6 外植體的接種 葉片的接種葉片接種前應(yīng)先對葉片進行預(yù)處理，首先將滅菌好的葉片放入已滅菌的帶濾紙的培養(yǎng)皿中，在濾紙上吸干葉片表面水分后，用解剖刀將葉片邊緣去掉，形成矩形，再將葉片切成約0.5cm0.5cm的小片，準(zhǔn)備接種。 莖尖的接種莖尖全部采取斜插入培養(yǎng)基的接種方法進行接種。接種前先將滅菌好的莖尖放入已滅菌的帶濾紙的培養(yǎng)皿中，將其表面的水吸干，再用鑷子小心將芽最外層的因滅菌而褐化死亡的葉片剝?nèi)ィ缓笥媒馄实肚腥パ炕壳o段的一部分制造傷

25、口后，將芽小心些插入培養(yǎng)基中即可將其放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)架培養(yǎng)。5 實驗方案二（葉子花）5.1 不同激素處理對葉子花外植體愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的影響處理6-BA mg/LNAA mg/L接種數(shù)量/個愈傷組織出現(xiàn)天數(shù)愈傷組織的形態(tài)、生長狀況產(chǎn)生愈傷組織數(shù)量/個愈傷組織誘導(dǎo)率/%1002020.202030.502040.50.12050.50.22060.50.5205.2 不同IBA濃度對葉子花生根的影響濃度/mg/L生根數(shù)/株根長/cm成活率/%00.51.02.06結(jié)果觀察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計 材料接種后，在固定周期內(nèi)（20-30d)對材料的污染率、褐化率、死亡率、愈傷啟動率以及愈傷組織誘導(dǎo)率等情況做觀察

26、記載及必要的統(tǒng)計，并根據(jù)需要調(diào)整試驗步驟。 啟動率未污染外植體啟動數(shù)/未污染外植體總數(shù)100 污染率接種污染數(shù)/接種總數(shù)100% 死亡率未污染死亡數(shù)/未污染總數(shù)100 褐化率未污染褐化數(shù)/未污染總數(shù)100 愈傷組織誘導(dǎo)率產(chǎn)生愈傷組織的塊數(shù)/接種的總塊數(shù)100 出芽率產(chǎn)生芽的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)100 平均芽數(shù)出芽總數(shù)/產(chǎn)生芽的愈傷組織塊數(shù) 生根率生根苗數(shù)/培養(yǎng)總苗數(shù)100 平均根長所有根長之和/總根數(shù) 平均根數(shù)所有根數(shù)之和/生根苗 其中，有部分外植體并未完全褐化，也長出部分愈傷組織，對于此種外植體，記錄數(shù)據(jù)時，既將其當(dāng)成褐化外植體同時也當(dāng)成產(chǎn)生愈傷的外植體。 調(diào)查的數(shù)據(jù)采用SPSS13

27、.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)的方差分析。四、結(jié)果觀察與分析對觀察的結(jié)果進行分析五、寫出課程論文實驗四 園藝植物莖尖脫毒培養(yǎng)一、 目的要求：練習(xí)對莖尖外植體的剝離、滅菌和接種等無菌的操作方法，熟悉快速繁殖和獲得無病毒植株的全過程。二、 材料用具：超凈工作臺、雙筒解剖鏡、剪刀、鑷子、解剖針、解剖刀、廣口瓶、燒杯、培養(yǎng)皿、酒精燈、升汞、酒精、吐溫20、無菌水、培養(yǎng)基、記號筆、紗布、酒精棉球、溫室盆栽葡萄、菊花的側(cè)芽、不結(jié)球白菜的側(cè)芽等材料。三、 說明：植物莖尖處于比較幼嫩的部位，其細胞具有旺盛的生能力，易于培養(yǎng)而獲得成功。莖尖培養(yǎng)根據(jù)其目的不同，取材的大小有較大的差異，較小的僅為十至幾十微米的莖尖分生組

28、織，較大的可利用幾十毫米的莖尖甚至更大的芽，但一般講莖尖愈小（小到50100微米的生度點）培養(yǎng)難度就越大，有的需要一年或更長的時間才能成苗，莖尖越大培養(yǎng)越易獲得成功。如果進行植物快速繁殖，則采用較大的莖尖，以帶有葉原基的生長為宜，這樣既能提高成活率，又能加快繁殖速度，如以脫毒為目的，則采用較小的莖尖，因為病毒在植株上的分布是不均勻，一般幼嫩的組織器官中病毒含量極低，以生長點含病毒最少，甚至不含病毒，所以進行脫毒種苗培養(yǎng)，應(yīng)盡量采用極小的莖尖生長點進行培養(yǎng)，以獲得脫毒苗。四、 方法和步驟（以葡萄為例）：（1）選擇品種性狀典型的，生長健壯無病蟲的葡萄植株，取其已萌動的頂芽或腋芽，或剪下35cm生長

29、的莖頂端，剝?nèi)ゴ笕~片，先在流水中沖流23小時，吸干水分，再在70%乙醇中浸半分鐘，然后放入0.1%升汞滴加12滴吐溫20的溶液中滅菌5分鐘，用無菌水沖洗35次。（2）在超凈工作臺上把滅菌的莖尖放在雙筒解剖鏡下剝?nèi)ポ^小的葉片，根據(jù)不同目的，可取只帶23個葉原基的生長點甚至不帶葉原基的生長點，或帶23片幼葉的莖尖。生長點剝離方法：在解剖鏡下，一手用鑷子夾住無菌的莖尖，一手用較細的解剖針剝掉生長點外圍的葉片，直至達到晶瑩發(fā)亮的光滑頂為止，然后用解剖刀仔細切取所需莖尖，隨即接種在預(yù)先配制好的培養(yǎng)基上。（3）培養(yǎng)基：莖尖分化培養(yǎng)基：MS+BA1mg/L+NAA0.01mg/L+LH100mg/L,生根培

30、養(yǎng)基：MS+IAA0.4mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.1mg/L.莖尖培養(yǎng)對培養(yǎng)容器無特殊要求，一般以15cm20cm的試管，或50ml三角瓶為宜，每支試管裝10ml培養(yǎng)基，每只三角瓶裝25ml培養(yǎng)基，每管或每瓶接種一個莖尖。（4）培養(yǎng)：接種的莖尖置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，溫度25攝氏度2攝氏度，光照2000Lux,以日光燈為光源，每天照光10小時。五、 作業(yè)：1、 每人接種莖尖4個，要求二個剝至帶23個葉原基的生長點。2、 定時觀察記錄：幼苗分化和生根情況。3、 試述利用莖尖培養(yǎng)為什么能夠脫除病毒。 實驗五 園藝植物的花藥培養(yǎng)一、 目的要求 學(xué)習(xí)園藝植物花藥的采集、滅菌、接種、培養(yǎng)等一整

31、套花藥培養(yǎng)的具體方法。二、 材料用具三、 樹型金銀花花藥、蘋果花藥、批杷花藥、不結(jié)球白菜花藥、番茄花藥、四季海棠花藥、天竺葵花藥等，紗布、塑料袋、三角瓶、70%酒精、冰箱、顯微鏡、醋酸洋紅、載玻片、蓋玻片、MS培養(yǎng)基的各種化學(xué)藥品。各種滅菌、接種、培養(yǎng)用具和器皿。四、 說明花藥培養(yǎng)是植物育種的一種有效方法，即用離體花藥培養(yǎng)的方法，使其中的花粉發(fā)育成一個完整的植株，這種花粉植株的染色體數(shù)目為體細胞的一半，稱為單倍體植物，據(jù)統(tǒng)治到1983年止，通過花藥培養(yǎng)已從250多種植物中得到了單倍體植株。利用花藥組織進行單倍體育種對多年生果樹和觀賞樹木而言比一、二年生植物具有特殊的意義，因為多年生木本植物的品

32、種幾乎都是雜合體，加之又多為異花授粉，難以純化，通過這一途徑獲得得單倍體后再使之加倍，就能得到純合二倍體，從而為準(zhǔn)確研究性狀遺傳規(guī)律和雜種優(yōu)勢的利用打下基礎(chǔ)。四、方法和步驟a) 鏡檢確定花粉發(fā)育期：園藝植物花藥培養(yǎng)是以采集花粉處于單核期的花藥進行培養(yǎng)易獲得成功。本實驗在培養(yǎng)前先采集處于該時期的花蕾利用醋酸洋紅壓片法進行鏡檢，選取適宜的花粉發(fā)育時期。選擇卡諾固定液淹沒浸泡，固定花蕾 24 h，然后用 70%酒精保存。制片前測量花的長度和直徑，再剝?nèi)』ㄋ幱谝粷崈舻妮d玻片上，分別用醋酸洋紅和美藍染液染色。用鑷子擠出花粉，夾出藥壁，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸取多余的染液，在目鏡為 10 倍、物鏡為 40

33、倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照。每 1 張片隨機選擇 67個視野 （沒有重疊部分）觀察統(tǒng)計處于各發(fā)育時期的花粉細胞數(shù)。花藥發(fā)育的時期和花蕾外觀形態(tài)之間的對應(yīng)關(guān)系為：花蕾長度 0.480.71 cm 處于單核早期，達到 71.0%；長度在 0.720.89 cm處于單核中期，達到 65.0%；長度在 0.901.02 cm 處于單核晚期，達到 67.3%；長度在 1.021.19 cm 處于有絲分裂前期，達到 60.8%；長度在 1.192.32 cm 處于二核期，達到59.8%。通過觀察樹型金銀花花蕾外觀形態(tài)，可以直觀確定花藥發(fā)育時期，為花藥單倍體培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)b) 預(yù)處理：采集花蕾，用濕紗布包好

34、放入塑料袋，置于35攝氏度冰箱中處理7天左右。培養(yǎng)基準(zhǔn)備：采用MS+6-BA 2mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖4%+pH 5.8-6.0或者MS +2，4-D0.4mg/L+KIN0.2mg/L+IAA4mg/L+蔗糖38%。c) 花藥滅菌及接種：接種前花蕾經(jīng)70%酒精中浸10秒，無菌水沖洗3遍，0.1%升汞滅菌68分鐘，然后用無菌水沖洗35次，在無菌條件下取出花藥進行接種，注意不要破壞花藥，每瓶接種2030個花藥。d) 誘導(dǎo)培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶置于溫度2530%，光強15002000Lux,每天光照相館0小時的培養(yǎng)室中，誘導(dǎo)形成體胚或愈傷組織。e) 分化及再生：將胚狀體或愈傷組織及時轉(zhuǎn)入分

35、化培養(yǎng)基，即在MS培養(yǎng)基中加入6BA。五、作業(yè)定時觀察：胚狀體和愈傷組織的分化情況。實驗六 植物體細胞胚胎的發(fā)生和懸浮體系的建立一、 目的要求 1.學(xué)習(xí)植物體細胞胚胎的發(fā)生及懸浮細胞的培養(yǎng)。2.培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力和實踐動手能力。3.培養(yǎng)學(xué)生綜合分析能力。二、 材料用具 香果樹幼嫩果實等，紗布、塑料袋、三角瓶、70%酒精、冰箱、顯微鏡、醋酸洋紅、載玻片、蓋玻片、MS培養(yǎng)基的各種化學(xué)藥品。各種滅菌、接種、培養(yǎng)用具和器皿。三、 說明植物組織培養(yǎng)的形態(tài)建成是細胞全能性表達的組成部分，它包含器官發(fā)生和體細胞胚胎(簡稱體胚)發(fā)生兩種基本途徑。體細胞胚胎發(fā)生是指在離體條件下植物的體細胞通過與合子胚發(fā)生相類似的

36、途徑發(fā)育成新個體的過程(Haccis1978)。體胚發(fā)生現(xiàn)象最早由Steward等(1958)在胡蘿卜根細胞離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，后來又陸續(xù)在單細胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)中觀察到。體胚發(fā)生具有單細胞起源的特點(Politoetal1989)，為基因工程、細胞工程等生物技術(shù)改良品種提供了良好的實驗體系。因此，70年代以來，這方面的研究與日俱增，已在43科79屬114種植物中有體胚發(fā)生的報道(周俊彥1982;湯浩茹等1999)。然而這些研究大部分局限于器官水平，即發(fā)生的形態(tài)學(xué)，生理學(xué)(酶代謝、蛋白代謝、核酸代謝以及激素、糖、多胺、金屬離子、微量元素、活性氧與體胚發(fā)生關(guān)系)的研究。隨著植物分子生

37、物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，植物體細胞胚胎發(fā)生的研究深入到分子水平，如體胚發(fā)生相關(guān)基因的分離、基因的表達調(diào)控、細胞的信號傳導(dǎo)等，目前已從胡蘿卜、擬南芥、煙草等模式植物體胚中克隆到大批基因，這些都為探討植物體胚發(fā)生的機理奠定了基礎(chǔ)。四、 方法和步驟1 材料與方法取幼嫩果實（果齡30d左右）在洗潔凈液中用軟刷洗，然后用洗潔凈液浸泡30min，自來水沖洗2h，在超凈工作臺上用75%酒精滅1min，0.1%HgCl2消毒15min，無菌水清洗5次。用手術(shù)刀縱向切開果皮，挑出未成熟種子備用。1.1胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將未成熟種子接種到附加2.0 mg .L-1 6-BA的MS（Murashige and Skoo

38、g 1962）固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，6d后產(chǎn)生淺綠色致密愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)4d后，將淺綠色愈傷組織轉(zhuǎn)到MS附加0.1 mg/L 6-BA、0.5 mg/LNAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 30d，淺綠色愈傷組織逐漸變?yōu)楹谏^代培養(yǎng)40d，從黑色的愈傷組織表面生長出淺黃色疏松的胚性愈傷組織。培養(yǎng)基中添加蔗糖濃度為3%（w/v），瓊脂0.8%（w/v）。用0.1molL-1HCl或0.1molL-1NaOH調(diào)節(jié)pH值，在滅菌前各培養(yǎng)基pH值為6.0，121滅菌20 min。培養(yǎng)溫度(252），光照強度2000umol/m2/s，光照時間16hd-1。1.2懸浮體系的建立1.2.1 球形胚聚合體的獲得將淺黃色胚性

39、愈傷接種到含0.5 mg .L-16-BA和0.5 mg .L-1NAA的MS液體培養(yǎng)基中，添加3%的蔗糖，100ml三角瓶中加50ml液體培養(yǎng)基。置搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度(252），光照強度1000 umol/m2/s，光照時間16hd-1。每14d繼代1次，繼代時用60目的尼龍網(wǎng)過篩處理，使其大小均一。繼代2次后，顯微觀察，懸浮培養(yǎng)物主要是由球形胚聚合體組成。將獲得的大小均一的球形胚聚合體作為初始材料用于篩選基本培養(yǎng)基，接種量，糖濃度和植物生長調(diào)節(jié)劑等對體細胞胚胎發(fā)生的影響。1.2.2不同接種量對球形胚聚合體生長的影響分別以0.4%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%（w/v）接種量（鮮重）將球形胚聚合體接種到含0.5 mg .L-16-BA和0.5 mg .L-1NAA的MS液體培養(yǎng)基中，添加3%的蔗糖，每處理4個重復(fù)，培養(yǎng)14d后，觀察球形胚聚合體的生長情況和統(tǒng)計其生長量。選取較優(yōu)的接種量2%處理組測定懸浮培養(yǎng)物生長過程中pH和生長量的變化，該處理進行4個重復(fù)，每隔2d取其充分搖勻的懸浮培養(yǎng)物5mL，離心(8000g，10min)，將沉淀稱重，同時測上清液pH值，共測定10次。基本培養(yǎng)基對球形胚聚合體生長