1、Fas和FasL在急性胰腺炎中的共表達(dá)及其與凋亡的關(guān)系 作者：李震東1；馬清涌1；徐軍1；李明2(西安交通大學(xué)1第一醫(yī)院肝膽外科，2醫(yī)學(xué)院組胚教研室，陜西西安710061)摘要：目的探討凋亡調(diào)控基因Fas、FasL在大鼠急性胰腺炎中的表達(dá)及其與腺泡細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法通過胰膽管內(nèi)逆行注射不同濃度的牛磺膽酸鈉，建立不同嚴(yán)重程度的急性胰腺炎模型，用RT-PCR、免疫組化法檢測(cè)胰腺組織Fas、FasL mRNA及蛋白的表達(dá)，原位末端標(biāo)記法檢測(cè)各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。結(jié)果在正常的胰腺腺泡細(xì)胞中即存在著Fas、FasL mRNA及蛋白的表達(dá)，且呈現(xiàn)共區(qū)域化特點(diǎn)，凋亡細(xì)胞極少。在炎癥程度較輕的胰腺組織，

2、Fas和FasL mRNA的表達(dá)水平顯著提高，腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)亦明顯提高，隨胰腺炎癥程度的加重，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達(dá)逐漸下降，腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)亦逐漸下降。結(jié)論Fas/FasL系統(tǒng)可能參與了正常胰腺組織的細(xì)胞更新和自穩(wěn)；是介導(dǎo)急性胰腺炎時(shí)腺泡細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要途徑。關(guān)鍵詞：急性胰腺炎；細(xì)胞凋亡；Fas；FasL中圖分類號(hào)：R657.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-4254(2006)01-0025-05Colocalized expression of Fas and Fas-Ligand in acute pancreatitis and its correlation wit

3、h cell apoptosisLI Zhen-dong1；MA Qing-yong1；XU Jun1；LI Ming2Department of Hepatobiliary Surgery, First Hospital of Xian Jiaotong University1, Department of Histoembryology, Medical College2, Xian Jiaotong University, Xian 710061, ChinaAbstract: Objective To study the expressions of Fas and Fas-Ligan

4、d (FasL) genes in rats with acute pancreatitis (AP) and their relation to apoptosis of pancreatic acinar cells. Methods Rat models of acute pancreatitis with varied severity were established by retrograde injection of sodium taurocholate at different concentrations via the apancreatobiliary duct. Th

5、e expressions of Fas and FasL mRNAs and proteins were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. The apoptosis of acinar cells was quantified by in situ nick ending-labeling technique. Results of expressions fas, FasL mRNA and protein were colocali

6、zed in normal pancreatic acinar cells. In pancreatic tissue with less severe inflammation, the expressions of Fas and FasL mRNA increased significantly, and the apoptosis index of the acinar cells was also elevated; with the increase in the severity of the pancreatitis, the expression of Fas and Fas

7、L mRNAs were gradually lowered and apoptosis index of the acinar cells was increased. ConclusionFas/FasL system might be involved in the renewal and homeostasis of normal pancreatic tissue, and constitute an important pathway mediating the apoptosis of pancreatic acinar cells in AP .Key words: acute

8、 pancreatitis; apoptosis; Fas; FasL收稿日期：2005-08-16基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(30371398)Supported by National Natural Science Foundation of China(30371398)作者簡(jiǎn)介：李震東(1969-)，男，外科主治醫(yī)師，博士研究生，電話E-mail: victor7922通訊作者：馬清涌，教授，博士生導(dǎo)師，電話E-mail：qyma0 近年來在多種急性胰腺炎動(dòng)物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡程度與急性胰腺炎胰腺炎癥的嚴(yán)重度呈負(fù)

9、相關(guān)性，誘導(dǎo)凋亡可明顯減輕急性胰腺炎病情1。Fas/FasL系統(tǒng)是許多疾病如肝炎和自身免疫性疾病等的細(xì)胞凋亡介質(zhì)，F(xiàn)as(CD95)是腫瘤壞死因子(TNF)受體家族I型跨膜蛋白及FasL的受體，相對(duì)分子質(zhì)量45 000； FasL是TNF家族型跨膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量40 000，F(xiàn)as與其配體FasL或Fas抗體結(jié)合可誘導(dǎo)Fas表達(dá)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但其在急性胰腺炎中的重要性尚未闡明，本文對(duì)此加以探討。1材料和方法1.1藥物與試劑牛磺膽酸鈉購(gòu)自Sigma公司，使用前以生理鹽水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液。總RNA提取試劑盒(TRI試劑)購(gòu)自美國(guó)MRC公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購(gòu)自Ferme

10、ntas公司，F(xiàn)as、FasL多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物制品有限公司，TUNEL法細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制備將40只SD雄性大鼠(購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量250300 g)隨機(jī)分成4組，每組10只， 經(jīng)十二指腸壁潛行穿刺膽胰管注射牛磺膽酸鈉以誘導(dǎo)急性胰腺炎(AP)。其中A組為假手術(shù)對(duì)照組，僅行剖腹探查，牽引胰腺后關(guān)腹；B、C、D組為AP模型組，分別給予2.0%、3.5%、5.0%牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g體質(zhì)量，建立不同炎癥程度的AP模型。術(shù)后6 h處死大鼠，快速切取胰尾部組織液氮保存?zhèn)銻NA提取，取病變較為一致的胰頭

11、部組織置4% PBS多聚甲醛中固定，4 m連續(xù)切片供HE染色及免疫組化研究。1.3胰腺組織病理?yè)p害評(píng)分常規(guī)制作胰腺病理HE切片，鏡下比較胰腺病理組織學(xué)改變，采用Schmidt2的胰腺組織學(xué)改變?cè)u(píng)分系統(tǒng)，由專人盲法在光鏡下按照水腫、腺泡細(xì)胞壞死、出血和脂肪壞死、炎癥和血管周圍浸潤(rùn)程度不同分04分評(píng)分。1.4RT-PCR法檢測(cè)胰腺組織Fas、FasL mRNA的表達(dá)用TRI試劑提取胰腺組織總RNA，將5 g總RNA反轉(zhuǎn)錄后行PCR。PCR擴(kuò)增體系25 l，其中含2PCR master mix 12.5 l，上、下游引物各0.75 l，cDNA模板(逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 l，以PTC-200型(MJ公司，

12、美國(guó))PCR儀作熱循環(huán)：預(yù)變性94 3 min；循環(huán)：94 45 s、60 45 s、72 45 s、共35循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72 10 min。Fas、FasL及內(nèi)參GAPDH引物由大連寶生物工程公司合成，引物序列如下：Fas 上游：5GATATGCTGTGGATCAT GGC 3，下游：5AACTTTTCGTTCACCAG 3(201 bp，下同)；FasL 上游：5ATGGAACTG CTTTGATCTCTGG 3，下游：5AGATTCCTCAAAA TTGATCAGAG 3(320 bp)； GAPDH 上游：5CATAG ACAAGATGGTGAAGG3，下游：5TCCACAGTCTT

13、 CTGAGTGGC 3(570 bp)。取PCR產(chǎn)物各5 l在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳(150 V恒壓電泳0.5 h)，應(yīng)用Gel-Doc2000型全自動(dòng)凝膠成像分析儀(Boi-Rad公司，美國(guó))照相并測(cè)定每條帶的光密度值，以GAPDH的表達(dá)量為內(nèi)對(duì)照計(jì)算并比較各組樣本Fas、FasL的相對(duì)表達(dá)量。1.5胰腺組織Fas、FasL免疫組化檢測(cè)兔抗大鼠Fas、FasL多克隆抗體，工作濃度均為1200。免疫組化操作過程按試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡觀察。1.6胰腺組織凋亡檢測(cè)采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行

14、。以雙蒸水代替TDT作陰性對(duì)照，DNAase 處理的切片作陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)染色結(jié)果于每張切片中選取10個(gè)高倍視野(400)，計(jì)數(shù)1000個(gè)胰腺腺泡細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(即每100個(gè)細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比)。1.7統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以(s)表示，以SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用單因素方差分析計(jì)算各組間差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1光鏡下胰腺組織學(xué)改變及病理評(píng)分對(duì)照組胰腺在光鏡下無(wú)異常或僅有輕度水腫；在造模后的B組，可見大鼠胰腺間質(zhì)水腫，小葉和腺泡間隙增寬，伴多量中性粒細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)可見點(diǎn)片狀出血和壞死，在牛磺膽酸鈉濃度逐漸增大的C

15、、D兩組，上述表現(xiàn)更加明顯，伴小葉結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞輪廊不清，胰腺壞死周圍小血管擴(kuò)張、紅細(xì)胞淤積并微血栓形成(表1)。 2.2Fas和FasLmRNA在正常胰腺及AP胰腺組織中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，正常胰腺組織即有Fas和FasL mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在AP炎癥程度較輕的B組，F(xiàn)as和FasL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，在AP模型C、D兩組，隨胰腺組織炎癥程度的加重，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達(dá)水平逐漸下降。且Fas 表達(dá)水平在各個(gè)組間的變化趨勢(shì)與FasL 的變化趨勢(shì)相一致(圖1，2)。 圖1Fas mRNA (A)和FasL mRNA (B)在正常和AP胰腺組織中的RT-PCR凝膠電

16、泳圖Fig.1Fas mRNA(A) and Fas Ligand mRNA(B) expression detected by RT-PCR in normal and acute inflammatory pancreasLanes 1-4: Fas (201bp) and FasL (320 bp); Lanes 5-8: GAPDH (570 bp); Lanes 1,5: Group A;Lanes 2, 6: Group B;Lanes 3, 7: Group C; Lanes 4, 8: Group D圖2Fas mRNA (A)和FasL mRNA (B)在正常和AP各胰腺組織

17、中的RT-PCR半定量分析Fig.2Changes of Fas mRNA (A)and Fas Ligand mRNA(B) expression analyzed by semiquantitative RT-PCR inthe pancreas of normal and acute inflammatory ratsaP0.05 vs control group,; bP0.05 compared within AP groups. A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively2.3胰腺組織Fas、FasL蛋白表達(dá)定位在正常胰腺組織中，F(xiàn)a

18、s和FasL呈弱陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)染成棕黃色，F(xiàn)asL也有少量胞膜著色，見于幾乎所有的腺泡細(xì)胞。連續(xù)切片分析顯示Fas和FasL共同表達(dá)于腺泡細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在AP模型B組，F(xiàn)as和FasL表達(dá)明顯增強(qiáng)，以炎癥浸潤(rùn)區(qū)和腺泡細(xì)胞壞死區(qū)最為顯著。隨胰腺炎癥程度的加重，F(xiàn)as、FasL的表達(dá)逐漸減弱。另外，F(xiàn)as和FasL也表達(dá)于正常的胰島細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，而胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、胰腺炎時(shí)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞內(nèi)均不表達(dá)(圖3)。 圖3連續(xù)切片免疫組化檢測(cè)正常及不同炎癥程度胰腺組織Fas、FasL蛋白表達(dá)定位Fig.3Immunohistochemistry of serial sections of normal

19、and inflammatory rat pancreas showing the expressions of Fas and FasL proteins (Originalmagnification: 200)A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively2.4TUNEL法檢測(cè)各組胰腺細(xì)胞凋亡情況比較細(xì)胞凋亡陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為胞核染成棕褐色，胞核固縮、空泡化，染色質(zhì)濃縮、邊聚，凋亡小體形成。結(jié)果可見正常組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡極少(圖4A)，建立AP模型后, B組胰腺炎程度較輕，凋亡細(xì)胞多見(圖4B)，C組病理改變較B組加重，凋亡細(xì)胞較多見(圖4C)，D組

20、為重度出血壞死性胰腺炎，凋亡細(xì)胞少見(圖4D)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)，各AP模型組與對(duì)照組凋亡指數(shù)相比(P0.01)，各AP模型組間比較(P0.01)，差異顯著。 圖4TUNEL原位末端標(biāo)記法檢測(cè)各組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡Fig.4In situ detection of apoptosis by terminal transferase mediated nick end labeling (TUNEL) showing brown and shrunk nuclei of the apoptotic cells with vacuolization, chromatin conden

21、sation, and formation of apoptotic bodies (Original magnification:400)A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively3討論Fas/FasL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡最主要的途徑之一，F(xiàn)as單抗誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)3。FasL和Fas結(jié)合后，首先使Fas形成能傳遞信號(hào)的活性三聚體， 并將凋亡信號(hào)向胞內(nèi)傳遞、激活一系列被稱為Caspase的半胱氨酸蛋白酶，完成細(xì)胞凋亡過程。有研究發(fā)現(xiàn)45，F(xiàn)as/FasL凋亡通道介導(dǎo)了急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as基因缺失可明顯加重蛙皮素誘導(dǎo)的鼠急性胰

22、腺炎病情，提示Fas凋亡通路在急性胰腺炎中扮演著重要的角色。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在正常的胰腺腺泡細(xì)胞中即存在著Fas和FasLmRNA及蛋白的表達(dá)，且呈現(xiàn)共區(qū)域化特點(diǎn)，這同Kornmann 等6的研究結(jié)果是一致的。Fas/FasL的共區(qū)域化表達(dá)同樣存在于胸腺、食管上皮78等組織中。提示正常組織的生理性細(xì)胞更新可能受Fas/FasL系統(tǒng)自分泌或旁分泌凋亡通路的調(diào)節(jié)。越來越多的證據(jù)表明Fas與FasL的相互作用有助于組織自穩(wěn)，如陰道上皮、肝臟和睪丸8。雖然Fas與FasL的共表達(dá)可能介導(dǎo)胰腺細(xì)胞凋亡，但Natoli 等9研究發(fā)現(xiàn)Fas/FasL系統(tǒng)的表達(dá)并不必然引起表達(dá)細(xì)胞的凋亡，F(xiàn)as/FasL凋亡

23、通道的啟動(dòng)尚需要協(xié)同刺激信號(hào)的存在。另外，凋亡是一個(gè)由多因素控制的精細(xì)過程，多種凋亡通路共同存在，保證了表達(dá)組織的自穩(wěn)和對(duì)外來刺激的適度反應(yīng)。在本研究中，我們通過經(jīng)胰膽管逆行注射不同濃度的牛磺膽酸鈉建立炎癥程度不一的AP模型，用TUNEL法檢測(cè)各組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率的變化，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡調(diào)控基因Fas和FasL mRNA的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，正常胰腺組織腺泡細(xì)胞凋亡率很低，建立AP模型后，在炎癥程度較輕的B組，腺泡細(xì)胞凋亡率明顯升高，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達(dá)水平亦隨之顯著升高；隨胰腺炎癥程度的加重，腺泡細(xì)胞凋亡率逐漸下降，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達(dá)亦逐漸下降。這

24、一結(jié)果再次證實(shí)在急性胰腺炎過程中，腺泡細(xì)胞凋亡與急性胰腺炎的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，腺泡細(xì)胞凋亡是對(duì)胰腺炎本身的一種保護(hù)性反應(yīng)。胰腺腺泡細(xì)胞凋亡至少部分是由Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)是介導(dǎo)胰腺炎細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。總之，我們的研究證實(shí)了Fas及FasL在正常胰腺細(xì)胞中呈共區(qū)域化表達(dá)及其與腺泡細(xì)胞凋亡的關(guān)系。這一結(jié)果表明，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)可能參與了正常胰腺組織的自穩(wěn)和細(xì)胞更新；Fas/FasL系統(tǒng)可能是急性胰腺炎病程中介導(dǎo)凋亡的一個(gè)重要通路，通過Fas/FasL系統(tǒng)誘導(dǎo)凋亡可以減輕急性胰腺炎病情。有關(guān)Fas/FasL通路調(diào)節(jié)凋亡的確切機(jī)制尚須進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)

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