1、基因工程原理練習題及其答案一、填空題1 基因工程是70年代發展起來的遺傳學的一個分支學科。2 基因工程的兩個基本特點是： (1)分子水平上的操作，(2)細胞水平上的表達3 基因克隆中三個基本要點是：克隆基因的類型；受體的選擇；載體的選擇4 通過比較用不同組合的限制性內切核酸酶處理某一特定基因區域所得到的不同大小 的片段，可以構建顯示該區域各限制性內切核酸酶切點相互位置的限制性酶切圖譜。5 限制性內切核酸酶是按屬名和種名相結合的原則命名的，第一個大寫字母取自屬名的第一個字母，第二、三兩個字母取自_種名的前兩個字母，第四個字母則用株名表示。6部分酶切可采取的措施有：(1)減少酶量；(2)縮短反應時

2、間；(3)增大反應體積等。7第一個分離的限制性內切核酸酶是EcoK；而第一個用于構建重組體的限制性內切核酸酶是_ EcoRl。8限制性內切核酸酶BsuRI和Hae的來源不同，但識別的序列都是GGCC，它們屬于異源同工酶。9DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_枯草桿菌蛋白酶切割DNA聚合酶I得到的分子量為76kDa的大片段，具有兩種酶活性： (1) 5'-3'合成酶的活性； (2) 3'-5'外切核酸酶的活性。10為了防止DNA的自身環化，可用堿性磷酸酶去雙鏈DNA_5端的磷酸基團。11EGTA是_Ca2+_離子螯合劑。12測序酶是修飾了的T7 DNA聚合酶，

3、它只有_ 5'-3'合成酶的活性，而沒有3'-5'外切酶的活性。13切口移位(nick translation)法標記DNA的基本原理在于利用DNA聚合酶I的_5'一3'外切核酸酶和5'一3'合成酶的作用。14欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈DNA分子轉變成平末端的雙鏈形式，通常可采用_ S1核酸酶切割或DNA聚合酶補平。15反轉錄酶除了催化DNA的合成外，還具有_核酸水解酶H的作用，可以將DNA- RNA雜種雙鏈中的_RNA_水解掉。16基因工程中有3種主要類型的載體：質粒DNA，病毒DNA，質粒和病毒DNA雜合體。17就克隆一個

4、基因(DNA片段)來說，最簡單的質粒載體也必需包括三個部分：_復制區： 含有復制起點；選擇標記： 主要是抗性基因；克隆位點： 便于外源DNA的插入。另外，一個理想的質粒載體必須具有低分子量。 18 一個帶有質粒的細菌在有EB的培養液中培養一段時間后，一部分細胞中已測 質粒消除(或治愈) 。19 pBR322是一種改造型的質粒，它的復制子來 不出質粒，這種現象叫源于pMBl ，它的四環素抗性基 因來自于pSCl01，它的氨芐青霉素抗性基因來自于pSF2124(R質粒)。20YAC的最大容載能力是1000kb，BAC載體的最大容載能力是 300kb 。21pSCl01是一種 嚴緊 復制的質粒。22

5、pUCl8質粒是目前使用較為廣泛的載體。pUC系列的載體是通過pBR322和M13 兩種質粒改造而來。它的復制子來自 pMBl ，Amp 抗性基因則是來自 轉座子。23噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是它在細菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNA的擴增； 二是對某些噬菌體(如l噬菌)的遺傳結構和功能研究得比較清楚，其大腸桿菌宿主系統的遺傳也研究得比較詳盡。24 野生型的M13不適合用作基因工程載體，主要原因是沒有合適的限制性內切核酸酶識別位點和 選擇標記。25 黏粒(cosmid)是質粒噬菌體雜合載體，它的復制子來自質粒、COS位點序列來自 l噬菌體，最大的克隆片段達到4

6、5 kb。26 野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是：(1) 分子量大，(2)酶的多切點，(3)無選擇標記27噬菌粒是由質粒和噬菌體DNA共同構成的，其中來自質粒的主要結構是復制區，而來自噬菌體的主要結構是 IG區 。28l噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，總的長度應在噬菌體基 因組的 75105 的范圍內。29 在分離DNA時要使用金屬離子螯合劑，如EDTA和檸檬酸鈉等，其目的是螯合Mg2+離子，抑制核酸酶的活性 。30 用乙醇沉淀DNA時，通常要在DNA溶液中加人單價的陽離子，如NaCl和NaAc，其目的是中和DNA分子的負電荷，增加DNA分子間的凝聚力。3

7、1 引物在基因工程中至少有4個方面的用途：(1)合成探針；(2)合成cDNA；(3)用于PCR反應；(4)進行序列分析32Clark發現用Taq DNA聚合酶得到的PCR反應產物不是平末端，而是有一個突出 堿基末端的雙鏈DNA分子。根據這一發現設計了克隆PCR產物的T載體。33在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 第二鏈合成時形成的發夾環 34乙醇沉淀DNA的原理是乙醇使DNA分子脫水。35 假定克隆一個編碼某種蛋白質的基因，必須考慮其表達的三個基本條件： (1)保持正確的可讀框 (2)能夠使其轉錄的啟動子 (3)具有翻譯的起始和終止信號36 受體細胞的感受態是接受外源DNA的生

8、理狀態_。37 DNA重組連接的方法大致分為四種：(1)黏性末端連接； (2)平末端連接；(3)同聚物接尾連接；(4)接頭連接法。38 將含有外源基因組一個酶切片段的質粒稱之為含有一個基因組DNA克隆_，各種此類質粒的集合體稱之為構建了一個基因組DNA文庫。39將含有一個mRNA的DNA拷貝的克隆稱作一個cDNA_克隆，源于同一批RNA制備物的克隆群則構建了一個_ cDNA文庫_。40只要知道基因組中某一特定區域的部分核苷酸組成，用_聚合酶鏈式反應(PCR)可以將這段DNA進行百萬倍的擴增。41人工感受態的大腸桿菌細胞在溫度為0°C 時吸附DNA, 42°C _時攝人DNA

9、。42目前，在重組體的篩選中，已經發展了許多構思巧妙、具有極高準確性的篩選方法。 大致可以分為：(1)遺傳學方法；(2)物理篩選法；(3)核酸雜交法；(4)表達產物分析法等。43PCR擴增篩選重組體是比較簡便的篩選方法，它適合于_插入外源片段的種類較多，大小又極為相似的重組體的篩選。44 核酸雜交探針可分為兩大類： DNA探針和RNA探針。其中DNA探針又分為_基因組DNA探針和cDNA 探針。45如果用限制性內切核酸酶切割雙鏈DNA產生5突出的黏性末端，則可以用_ Klenow酶填補的方法_進行3末端標記。如果用限制性內切核酸酶切割DNA產生的是3突出的黏性末端，可以用_ T4DNA聚合酶進

10、行3末端標記。46單鏈DNA探針的標記可以采用下列方法：(1)用M13噬菌體載體合成單鏈DNA探針；(2)從mRNA反轉錄合成單鏈cDNA探針；(3)用不對稱PCR合成單鏈DNA探針。47根據Northern雜交的結果可以說明：外源基因是否進行了轉錄_。48差示雜交(differential hybridization)技術需要_兩種不同的細胞群體能夠表達不同的基因，即在一個群體中能夠表達一些基因，而在另一個細胞群體中不能表達這些基因。49RNA分子經凝膠電泳后按大小不同分開，然后被轉移到一張硝酸纖維素膜(尼龍膜) 上，同一放射DNA探針雜交的技術稱_ Northern印跡_。50在_ Sou

11、thern印跡_技術中，DNA限制性片段經凝膠電泳分離后，被轉移到硝酸纖維素膜(或尼龍膜)上，然后與放射性的DNA探針雜交。51可用T4 DNA聚合酶進行平末端的DNA標記，因為這種酶具有_5®3合成酶_和_3 ®5外切核酸酶_的活性。52根據外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必需考慮三種因素：(1)克隆的是完整的基因；(2)使用的是表達載體；(3)不含內含子。53Northern印跡和Southern印跡有兩點根本的區別： (1)印跡的對象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；(2)電泳條件不同，前者是變性條件，后者是非變性條件。54放射免疫篩選的原理

12、基于以下三點：(1)抗體能夠被吸附到固體支持物上；(2)同一個抗原可以同幾種抗體結合； (3)抗體能夠被標記二、選擇題(單選或多選)1 因研究重組DNA技術而獲得諾貝爾獎的科學家是( ) (a)AKornberg (b)WGilbert (c)PBerg (d)BMcClintock2 第一個作為重組DNA載體的質粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl83 關于宿主控制的限制修飾現象的本質，下列描述中只有( )不太恰當。 (a)由作用于同一DNA序列的兩種酶構成 (b)這一系統中的核酸酶都是類限制性內切核酸酶 (c)這一系統中的修飾酶主要是通過甲基

13、化作用對DNA進行修飾 (d)不同的宿主系統具有不同的限制-修飾系統4型限制性內切核酸酶： ( ) (a)有內切核酸酶和甲基化酶活性且經常識別回文序列 (b)僅有內切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供 (c)限制性識別非甲基化的核苷酸序列 (d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供5下面有關限制酶的敘述哪些是正確的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是內切酶 (b)限制酶在特異序列(識別位點)對DNA進行切割 (c)同一種限制酶切割DNA時留下的末端序列總是相同的 (d)一些限制酶在識別位點內稍有不同的點切割雙鏈DNA，產生黏末端 (e)一些限

14、制酶在識別位點內相同的位置切割雙鏈DNA，產生平末端6第一個被分離的類酶是： ( ) (a)EcoK (b)Hind (c)Hind (d)EcoB7在下列進行DNA部分酶切的條件中，控制那一項最好?( ) (a)反應時間 (b)酶量 (c)反應體積 (d)酶反應的溫度8在下列試劑中，那一種可以螯合Ca2+離子?( ) (a)EDTA (b)檸檬酸鈉 (c)SDS (d)EGTA9在下列工具酶中，那一種可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1單鏈核酸酶 (b)末端轉移酶 (c)堿性磷酸酶 (d)Bal 31核酸酶10限制性內切核酸酶可以特異性地識別： ( ) (a)雙鏈DNA的特定堿基對 (

15、b)雙鏈DNA的特定堿基序列 (c)特定的三聯密碼 (d)以上都正確11下列關于限制性內切核酸酶的表示方法中，正確一項的是( )。 (a)Sau3A I (b)EcoRI (c)hind III (d)Sau 3A112限制性內切核酸酶的星號活性是指：( )(a)在非常規條件下，識別和切割序列發生變化的活性。 (b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快 (d)識別序列與原來的完全不同13下面哪一種不是產生星號活性的主要原因?( ) (a)甘油含量過高 (b)反應體系中含有有機溶劑 (c)含有非Mg2+的二價陽離子 (d)酶切反應時酶濃度過低14關于宿主控制的限制修飾現象的本質，下列描述中只有(

16、 )不太恰當 (a)由作用于同一DNA序列的兩種酶構成 (b)這一系統中的核酸酶都是類限制性內切核酸酶 (c)這一系統中的修飾酶主要是通過甲基化作用對DNA進行修飾 (d)不同的宿主系統具有不同的限制-修飾系統15在長模板鏈的指導下引物延伸合成長的DNA互補鏈時應選用( ) (a)T4DNA聚合酶 (b)Klenow酶 (c)大腸桿菌DNA聚合酶I (d)T7DNA聚合酶16末端轉移酶是合成酶類，( ) (a)作用時不需要模板 (b)在Ca2+的存在下，可以在突出的3，末端延長DNA鏈 (c)在Ca2+的存在下，可以在隱蔽的3，末端延長DNA鏈(d)上述說法有兩種是正確的17在基因工程中，可用

17、堿性磷酸酶( ) (a)防止DNA的自身環化 (b)同多核苷酸激酶一起進行DNA的5，末端標記 (c)制備突出的3，末端 (d)上述說法都正確18下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性 (a)核酸外切酶 (b)外切酶 (c)單核苷酸激酶 (d)堿性磷酸酶19 下列哪一種酶作用時需要引物? ( ) (a)限制酶 (b)末端轉移酶 (c)反轉錄酶 (d)DNA連接酶20S1核酸酶的功能是( ) (a)切割雙鏈的DNA (b)切割單鏈的RNA (c)切割發夾環 (d)以上有兩項是正確的21Klenow酶與DNA聚合酶相比，前者喪失了( )的活性。 (a)5，-3，合成酶， (b)3，-5，外切酶 (

18、c)5，-3，外切酶 (d)轉移酶22 下面關于松弛型質粒(relaxed plasmid)性質的描述中，( )是不正確的 (a)質粒的復制只受本身的遺傳結構的控制，而不受染色體復制機制的制約， 因而有較多的拷貝數 (b)可以在氯霉素作用下進行擴增 (c)通常帶有抗藥性標記 (d)同嚴緊型質粒融合后，雜合質粒優先使用松弛型質粒的復制子 23 基因工程中所用的質粒載體大多是改造過的，真正的天然質粒載體很少，在下列載 體中只有( )被視為用作基因工程載體的天然質粒載體 (a)pBR322 (b)pSCl01 (c)pUBll0 (d)pUCl8 24 下列哪種克隆載體對外源DNA的容載量最大?(

19、) (a)質粒 (b)黏粒 (c)酵母人工染色體(YAC) (d) l噬菌體 (e) cDNA表達載體 25. 松弛型質粒： ( ) (a)在寄主細胞中拷貝數較多 (b)可用氯霉素擴增 (c)一般沒有選擇標記 (d)上述(a)、(b)兩項正確 26Col El是惟一用作基因工程載體的自然質粒，這種質粒： ( ) (a)是松弛復制型 （b)具有，四環素抗性 (c)能被氯霉素擴增 (d)能產生腸桿菌素27同一種質粒DNA，以三種不同的形式存在，電泳時，它們的遷移速率是：( ) (a)OCDNA>SCDNA>LDNA (b)SCDNA>LDNA>OCDNA (c)LDNA&g

20、t;OCDNA>SCDNA (d)SCDNA>OCDNA>LDNA28pBR322是一種改造型的質粒，含有兩個抗性基因，其中四環素抗性基因來自： ( ) (a)ColEl (b)Ri質粒 (c)pSCl01 (d)pUCl829關于穿梭質粒載體，下面哪一種說法最正確?( ) (a)在不同的宿主中具有不同的復制機制 (b)在不同的宿主細胞中使用不同的復制起點 (c)在不同的宿主細胞中使用不同的復制酶 (d)在不同的宿主細胞中具有不同的復制速率30能夠用來克隆32kb以下大小的外源片段的質粒載體是( ) (a)charomid (b)plasmid (C)cosmid (d)ph

21、agemid31第一個作為重組DNA載體的質粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl832. Ti質粒：( ) (a)可從農桿菌轉到植物細胞中 (b)作為雙鏈DNA被轉移 (c)在植物中導致腫瘤 (d)介導冠癭堿的合成，作為細菌的營養物和植物的生長激素 (e)需要細菌的vir基因幫助轉移 (f)在植物細胞中作為染色體外質粒33黏粒(cosmid)是一種人工建造的載體，( ) (a)它具有COS位點，因而可進行體外包裝 (b)它具有質粒DNA的復制特性 (c)進入受體細胞后，可引起裂解反應 (d)進入受體細胞后，可引起溶源化反應34有兩種確定核酸中核苷

22、酸序列的方法：化學序列分析法(Maxam-Glbert)和酶學序列分析法(Sanger)。酶學測序法的基本原理優點是：( ) (a)堿基與特殊染料間不同的相互作用 (b)一個合成引物的延伸和DNA修復合成的可靠終止 (c)限制性位點與DNA末端標記的相關性 (d)可同時對DNA雙螺旋的兩條鏈進行測序 (e)反應是DNA特異的，RNA不會帶來干擾。這樣既減少純化步驟，也節約了開支。35關于cDNA的最正確的說法是：( ) (a)同mRNA互補的單鏈DNA (b)同mRNA互補的雙鏈DNA (c)以mRNA為模板合成的雙鏈DNA (d)以上都正確36用堿法分離質粒DNA時，染色體DNA之所以可以被

23、除去，是因為：( ) (a)染色體DNA斷成了碎片 (b)染色體DNA分子量大，而不能釋放 (c)染色體變性后來不及復性 (d)染色體未同蛋白質分開而沉淀37. 關于堿解法分離質粒DNA，下面哪一種說法不正確?( ) (a)溶液I的作用是懸浮菌體 (b)溶液的作用是使DNA變性 (c)溶液的作用是使DNA復性 (d)質粒DNA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復性38. Clark做了一個有趣的實驗，發現TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在雙鏈DNA的 末端加一個堿基，主要是加( ) (a)dGTP (b)dATP (c)dCTP (d)dTTP39根據構建方法的不同，基因文庫分為基因組文

24、庫、cDNA文庫等。在下列文庫中， ( )屬cDNA文庫 (a) YAC文庫 (b) MAC文庫 (c) 扣減文庫 (d) BAC文庫40下面關于多克隆位點(multiple clone site,MCS)的描述，不正確的句是( ) (a)僅位于質粒載體中 (b)具有多種酶的識別序列 (c)不同酶的識別序列可以有重疊 (d)一般是人工合成后添加到載體中41在cDNA技術中，所形成的發夾環可用( ) (a)限制性內切核酸酶切除 (b)用3¹外切核酸酶切除 (c)用S1核酸酶切除 (d)用5¹外切核酸酶切除42在DNA的酶切反應系統中，通常：( ) (a)用SSC緩沖液 (b)

25、加入Mg2+作輔助因子 (c)加入BSA等保護劑 (d)上述說法中，有兩項是正確的43 黏性末端連接法，不僅操作方便，而且( ) (a)產生新切點 (b)易于回收外源片段 (c)載體不易環化 (d)影響外源基因的表達44在下列表型中，( )是基因工程上理想的受體菌表型 (a)r+m+rec* (b)r-m-rec- (C)r-m-rec+ (d)r+m+rec-45關于DNA接頭在基因工程中的作用，下列說法中哪一項不正確?( ) (a)給外源DNA添加適當的切點 (b)人工構建載體 (c)調整外源基因的可讀框 (d)增加調控元件46cDNA文庫包括該種生物的( ) (a)某些蛋白質的結構基因

26、(b)所有蛋白質的結構基因 (c)所有結構基因 (d)內含子和調控區47下列關于建立cDNA文庫的敘述中，哪一項是錯誤的?( ) (a)從特定組織或細胞中提取DNA或RNA (b)用反轉錄酶合成mRNA的對應單鏈DNA (c)以新合成的單鏈DNA為模板合成雙鏈DNA (d)新合成的雙鏈DNA甲基化 48下列對黏性末端連接法的評價中，哪一項是不正確的? ( ) (a)操作方便 (b)易于回收片段 (c)易于定向重組 (d)載體易于自身環化，降低重組率49關于感受態細胞性質的描述，下面哪一種說法不正確?( ) (功具有可誘導性 (b)具有可轉移性 (c)細菌生長的任何時期都可以出現 (d)不同細菌

27、出現感受態的比例是不同的50下面關于用T4多核苷酸激酶標記5' 端制備探針的描述中( )是不正確的。 (a)既能標記DNA，又能標記RNA (b)既能標記雙鏈DNA又能標記單鏈DNA (c)只能標記突出的5' 端不能標記其他類型末端 (d)DNA或RNA必須有5'-OH的存在51Southem印跡的DNA探針( )雜交。 (a)只與完全相同的片段 (b)可與任何含有相同序列的DNA片段 (c)可與任何含有互補序列的DNA片段 (d)可與用某些限制性內切核酸酶切成的DNA片段 (e)以上都是52 用下列方法進行重組體的篩選，只有( )說明外源基因進行了表達。 (a)Sou

28、them印跡雜交 (b)Northem印跡雜交 (c)Western印跡 (d)原位菌落雜交53下列哪一個不是Southern印跡法的步驟?( ) (a)用限制酶消化DNA (a)DNA與載體的連接 (c)用凝膠電泳分離DNA片段 (d)DNA片段轉移至硝酸纖維素膜上 (e)用一個標記的探針與膜雜交54 報告基因( ) (a)以其易于分析的編碼序列代替感興趣基因的編碼序列 (b)以其易于分析的啟動子區代替感興趣基因的啟動子區 (c)能用于檢測啟動子的活性 (d)能用于確定啟動子何時何處有活性55 在利用lacZ失活的顯色反應篩選法中，IPTG的作用是( ) (a)誘導宿主的肽的合成 (b)誘導

29、宿主的肽的合成 (c)作為酶的作用底物 (d)作為顯色反應的指示劑56. 切口移位是指在( )作用下，使( )帶上放射性標記。 (a)DNA聚合酶I，RNA (b)DNA聚合酶I，DNA (c)DNA聚合酶，RNA (d)DNA聚合酶，DNA57用于核酸分子雜交的探針可以是放射性標記的( ) (a)DNA (b)RNA (c)抗體 (d)抗原58Southern印跡是用DNA探針檢測DNA片段，而Northern印跡則是：( ) (a)用RNA探針檢測DNA片段 (b)用RNA探針檢測RNA片段 (c)用DNA探針檢測RNA片段 (d)用DNA探針檢測蛋白質片段59用免疫化學法篩選重組體的原理

30、是( ) (a)根據外源基因的表達 (b)根據載體基因的表達 (c)根據mRNA同DNA的雜交 (d)根據DNA同DNA的雜交 60隨機引物標記探針，下列各項中哪一項是不正確的?( ) (a)雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA都是可以標記的 (b)不需要用Dnase I預處理 (c)反應時可用Klenow酶 (d)反應時可用DNA聚合酶1 61在切口移位標記DNA探針時只能使用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)DNA聚合酶 (d)DNA聚合酶 62要對一雙鏈的DNA分子進行3¹末端標記，可用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶

31、 (d)T7DNA聚合酶答案1c；2c； 3b； 4b 5b，C，d，e； 6c； 7b； 8d；9d； 10B； 11d； 12a； 13d； 14b 15d； 16c；17a，b；18a；19c；20d；21c；22C； 23b； 24C；25d；26a，C，d；27b；28c； 29b；30a；31c； 32a,c,d,e， 33a，b，c；34b； 35c；36c； 37d； 38b；39c；40a；41c； 42a，b，c； 43b； 44b； 45d； 46a；47a； 48c； 49c；50b；51c； 52c； 53b； 54a,c,d；55a； 56b；57a，b； 58c；

32、59a；60d；61b； 62c；三、簡答題1說明Sanger DNA測序法的原理。Sanger DNA測序法是建立在兩個基本原理之上：(1)核酸是依賴于模板在聚合酶的 作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶參與了細菌修復DNA合成過程)；(2)可延 伸的引物必須能提供游離的3'羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的3'羥基末 端，因此會終止聚合反應的進行。如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應，則會獲 得4組長度不同的DNA片段。通過比較所有DNA片段的長度可以得知核苷酸的 序列。2某學生在用EcoRI切割外源DNA片段時，出現了星號活性，請分析可能的原因?鹽離子

33、濃度不對，溫度不對，甘油濃度過高。3在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一個6bp的類限制性內切核酸酶的識別序列，該位點的序列可能是什么? 回文序列是：5'-CATATG-3，4下面幾種序列中你認為哪一個(哪些)最有可能是類酶的識別序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 為什么?GATATC；AAATTT，因為它們是回文序列。5當兩種限制性內切核酸酶的作用條件不同時，若要進行雙酶切，應采取什么措施?為什么?注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一 種酶失活，再加第二種酶，否則，易產生星活性。或

34、使用通用緩沖液。6 為什么反轉錄酶在聚合反應中會出錯?由于反轉錄酶缺少在Ecoli DNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚合反應往往會出錯，在高濃度的dNTP和Mg2+下，每500個堿基中可能有一個錯配。7 什么是測序酶(sequenaseTM)?所謂測序酶即是修飾了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，從外切核酸酶結構域中除去28個氨基酸，這樣使T7 DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'-3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了39倍，測序時常用此酶。8 什么是S1核酸酶作圖(S1 nuclease ma

35、pping)? S1核酸酶作圖是一種對RNA轉錄產物的末端和剪接位點進行作圖的方法9 YAC載體具有什么樣的功能性DNA序列?為什么在克隆大片段時，YAC具有優越 性?YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復制起點，兩個端粒。YAC能夠容納長達幾百kb的外源DNA，這是質粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數目。10 列舉質粒載體必須具備的4個基本特性。 (1)獨立復制； (2)有選擇標記； (3)有獨特的酶切位點； (4)能轉化但不擴散。11 什么叫穿梭載體？ 含有細菌質粒和克

36、隆的真核生物DNA片段的雜種質粒，有兩個復制起點和既能在細菌又能在真核細胞中進行選擇的選擇標記，所以，很容易從一宿主轉到另一個宿主(來回穿梭)。12 如何將野生型的l噬菌體改造成為一個理想的載體? (1)削減分子量(除去非必需區和整合區)； (2)削減酶切位點； (3)添加選擇標記； (4)引入終止突變13 PCR的基本原理是什么?用PCR擴增某一基因，必須預先得到什么樣的信息? (1)DNA半保留復制的原理，在體外進行DNA的變性、復性和引物延伸。 (2)至少要預先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。14 cDNA克隆與基因組克隆有何不同? 基因組克隆包含所有不在cDNA中出現的內含子。15

37、 怎樣將一個平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點中去?化學合成一些長為10bp含有EcoRI識別位點的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會產生EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內切酶位點中16 簡述以黏粒為載體構建基因文庫的原理。 (1)COS位點可以自身環化； (2)可以利用COS位點包裝l噬菌體顆粒； (3)可以感染寄主細胞； (4)利用質粒復制子復制，不整合、不裂解。17 酵母人工染色體要在酵母細胞中穩定存在，必須有哪些基本的結構? (1)著絲粒； (2)端粒； (3)ARS序列。18 何謂YAC? 主要

38、特性是什么? (1)含有來自其他生物DNA的酵母人工染色體，叫YAC； (2)主要特性是可以克隆較大的外源片段。19 Muller的PCR反應同大腸桿菌體內的DNA復制有哪些不同?你認為根本的差別在 哪里? PCR用雙引物，體內復制用單引物。20欲將一真核生物的結構基因克隆后轉移到原核生物(如Ecoli)中進行表達，克隆時應注意哪些問題?應注意的問題有：啟動子、密碼子、剪接、分泌。21假定你分離到一個Ecoli的Thy- 突變體，并推測有可能是ThyA基因突變。請設計 一個方案用PCR從染色體DNA擴增突變的ThyA基因，測定突變的序列。(注：Ecoli野生型的ThyA基因的序列是已知的)為了

39、擴增突變體的thyA基因，先設計一對引物，其中一個引物的序列與thyA基因的5端相同，另一個引物同該基因的3端互補。在引物的5端加上合適類限制性內切核酸酶的識別序列，以便于后來的克隆。將染色體DNA同引物混合后，進行PCR擴增。然后進行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴增片段，可以直接測序或克隆到合適的載體再測序。22 你在做Southern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據方案，下面一步驟 是用NaOH溶液浸泡凝膠，使DNA變性為單鏈。為了節省時間，你略過了這一步， 直接將DNA從凝膠轉至硝酸纖維素膜上。然后用標記探針雜交，最后發現放射自顯影片是空白。錯在哪里?如果你的雜交探針是雙鏈的，可能因為

40、在加人雜交混合物之前忘記將探針變性而得到空白的放射自顯影結果。23切口移位(nick translation)標記探針的主要步驟有哪些? (1)DNaseI造成切口； (2)DNA聚合酶III的5 ®3外切核酸酶進行切割； (3)DNA聚合酶的5®3合成酶進行修補； (4)在修補過程中，隨著切口(nick)的移動，將放射性的底物摻人到雙鏈DNA中。24用EcoRI和Hind 分別切割同一來源的染色體DNA，并進行克隆，在前者的克隆中篩選到A基因，但在后者的克隆中未篩選到A基因，請說明原因。 原因是：Hind的切點在A基因內。25什么是Western印跡?它與Southern

41、印跡有什么不同?Western印跡是將蛋白質經電泳分離后從凝膠中轉移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進行檢測。它與Southern的不同在于探針的性質不同，在Western印跡中使用的探針是抗體(蛋白質)。26用一限制性內切核酸酶切割Lac+ Tet+的質粒載體，已知該酶識別的是4個堿基序列， 并產生有兩個堿基突出的單鏈末端，該酶在lac基因內有切割位點，并在第二個氨基 酸密碼子內，該位點可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用 DNA聚合酶將單鏈末端補齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環，轉化Lac- Tets受體菌，篩選Tetr轉化子，問：Lac的基因型是什么?并說明原因。基

42、因型是lac-原因是在該密碼子中插入了兩個堿基，造成了移碼突變，所以Lac的基因是缺陷的。27在基因工程中，為了在細菌細胞中表達真核生物的基因產物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細菌的啟動子? 這是因為細菌沒有內含子剪接系統，并且不能識別真核生物的啟動子之故。四、問答題：1 說明限制性內切核酸酶的命名原則要點。2 什么是限制性內切核酸酶的星號活性? 受哪些因素影向?3 影響DNA連接酶催化連接反應的因素有哪些?4 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5細菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?6外切核酸酶(

43、1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么應用?7Mn2+、Mg2+對Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影響?Dnase I在基因工程中有什么作用?8質粒如何維持在細胞中的穩定？9由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全，進行 嚴格的監控，質粒載體的安全性是十分重要的。請問質粒載體的安全條件包括哪幾 個方面?10為什么野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?11 什么是藍白斑篩選法?12 藍白斑篩選法為什么也會有假陽性?13 M13系列載體具有哪些優缺點?14黏粒載體具有哪些特點與不足?15輔助噬菌體

44、DNA和相應的噬菌粒是如何協同工作的?16 如果知道某一基因的功能及其相應的蛋白質的氨基酸序列組成，可以通過何種方法 克隆該基因?17 什么是基因文庫?18 什么是基因組文庫(genomic library)?構建基因組文庫，涉及哪些基本過程?它同遺 傳學上的基因庫有什么不同?19 什么是cDNA文庫(complementDNAlibrary)?同基因組文庫有何差別?20 黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優點，但是也有一些不足，請指出 這些不足之處。21什么是同聚物加尾連接法(homopolymer tails joining)?用何種方法加尾?具有哪些優 缺點?22何謂接頭連接法(

45、1inker ligation)?23什么是同裂酶?為什么說用同裂酶進行體外重組效率最高?24為了大量獲得許多用于生化鑒定的產物，你想將擬南芥中的一個序列已知、編碼單 體酶蛋白的基因在單細胞微生物中表達，你如何確保最終能得到產物?25某一質粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內有一Bgl I的切點。現用 Bgl I切割該載體進行基因克隆，問：(1)轉化后涂皿時應加什么樣的抗生素?(2)培 養后長出的菌落具有什么樣的抗性基因型?(3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片 段的重組體?26 以pBR322 DNA作為載體，從四環素抗性基因區克隆外源DNA時，可采用環絲氨 酸富集法篩選重

46、組體，說明其基本原理和基本操作過程。27 放射性抗體檢測法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?28 什么是隨機引物(random primer)?如何標記DNA?29什么是印跡(blotting)雜交?30什么是原位菌落雜交(colony hybridization)?31說明Southern雜交的原理和方法。32Northern印跡與Southern印跡有什么不同?33建立了一個基因文庫后，如何鑒定一個攜帶目的基因的克隆?答案： 1 答： 限制性內切核酸酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的各一個首字母，再加上序號。 基本原則： 3-4個字母組成，方

47、式是：屬名+種名+株名+序號； 首字母： 取屬名的第一個字母，且斜體大寫；第二字母： 取種名的第一個字母，斜體小寫； 第三字母： (1)取種名的第二個字母，斜體小寫； (2)若種名有詞頭，且已命名過限制酶，則取詞頭后的第一字母代替。 第四字母： 若有株名，株名則作為第四字母，是否大小寫，根據原來的情況而定， 但用正體。 順序號： 若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、 等，用正體。2 答： 類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限 制，即在一定環境條件下表現出來的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會松 動，識別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性

48、通常稱第二活性，而將這種因 條件的改變會出現第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星 活性。 概括起來，誘發星活性的因素有如下幾種：(1)高甘油含量(>5, vv)；(2)限制性 內切核酸酶用量過高(>100UugDNA)；(3)低離子強度(<25 mmolL)；(4)高pH(80 以上)；(5)含有有機溶劑，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二價陽離子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3 答： 影響DNA連接酶催化連接反應的因素有很多，但溫度對連接反應的影響較大。黏性末端鏈通常以12°C一15°C最好，這種溫度有

49、利于末端退火和連接酶的活性穩定。溫度高了難以進行末端退火，低于上述溫度會降低連接酶的活性。平末端連接以室溫為宜，因為平末端連接不存在DNA的退火問題，但是溫度高于30，連接酶特別不夠穩定。平末端連接時連接酶的濃度要比黏性末端連接時高10-100倍。DNA中有殘存的tRNA不會抑制DNA連接酶的活性，但是，如果NaCl的濃度高于150mmolL，則對連接反應有強的抑制作用。 另外反應體系中有NH4+離子的存在，對Ecoli DNA連接酶具有激活作用。Ecoli DNA 連接酶需要NAD+作輔助因子，而T4 DNA連接酶需要ATP。4 答： Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水

50、解DNA聚合酶I，得到兩個片段，其中大片段的分子量為75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中會降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。 Klenow酶主要有下列用途： (1)修復反應，制備平末端 可用Klenow酶修復限制性內切核酸酶或其他方法產生的5'或3'突出末端，制備平末端，這樣可以使原來具有不相容的黏性末端的DNA片段通過平末端重組。如在反應系統中加入放射性同位素標記的脫氧核苷酸，用

51、這種末端填補的方法可以制備3'末端標記的探針。 用Klenow酶修復5'突出末端的反應主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填補反應；而修復3'突出末端則是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反應。用Klenow酶的切割反應來修復3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。 (2) 標記DNA3'突出末端(protruding end) 該反應分兩步進行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，產生3'隱含末端，然后在高濃度的標記底物( -32p-d

52、NTP)存在下，使降解(3'-5')作用與聚合(5'-3')作用達到平衡。這種反應也叫交換或取代反應(exchangereplacement reaction)。不過這一反應用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性較強。 (3)其他的一些用途：包括用雙脫氧末端終止法進行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primer extension)制備單鏈DNA探針等。5答： 主要差別是：CIP68°C時失活，而BAP68°C穩定，且耐酚抽提。應用： (1)dsDNA的5'端脫磷酸，防止DNA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去后，再進行連接反應。 (2)DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進行末端標記。6答： 外切核酸酶是從 噬菌體感染的Ecoli中分離純化的，能夠從雙鏈DNA上依次切下5'單核苷酸，作用底物是雙鏈DNA的5'磷酸末端，不能切割羥基化5'端。該酶雖然能切割單鏈DNA,但效