1、PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR試劑盒的組成試劑盒的組成n核酸提取試劑n核酸擴增或逆轉錄-核酸擴增試劑n產物檢測試劑（有些使用全自動分析儀的PCR方法因其核酸擴增和檢測同時完成，故無專門的產物檢測試劑）影響影響PCRPCR試劑盒質量的因素試劑盒質量的因素n內在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學設計影響影響PCRPCR試劑盒質量的因素：試劑盒質量的因素： 擴增所需的原材料擴增所需的原材料n寡核苷酸引物和探針n緩沖液和dNTPn聚合酶、逆轉錄酶等PCRPCR反應混合物反應混合物 Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpE

2、rase 生 物 素 標 記 的 引 物 和和 或或 和和寡核苷酸引物和探針寡核苷酸引物和探針n其對試劑盒質量的影響首先是純度。其對試劑盒質量的影響首先是純度。純度的判斷可根據260/280吸光度比值來判斷，如2.0，則需重新純化。另一種方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現一條以上的帶或遷移位置錯誤，則需重新純化。n是否有污染。是否有污染。n結合特異性（濃度）結合特異性（濃度）dNTPdNTP和緩沖液和緩沖液ndNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的濃度n緩沖液：在儲存和擴增循環中穩定、作為聚合酶活性所必須的Mg（或用于rTth的Mn）的濃度以及pH等逆轉

3、錄酶、逆轉錄酶、DNADNA聚合酶聚合酶n酶的濃度n酶的活性核酸擴增方法核酸擴增方法nPCRnRTPCRn轉錄依賴的擴增（TMA）n連接酶鏈反應（LCR）n鏈替代擴增（SDA）等影響影響PCRPCR試劑盒質量的因素：試劑盒質量的因素： 核酸提取核酸提取n核酸提取的有效性n核酸提取的簡便性 影響影響PCRPCR試劑盒質量的因素：試劑盒質量的因素： 產物檢測產物檢測n雜交固相n特異探針及其標記物影響影響PCRPCR試劑盒質量的因素試劑盒質量的因素n內在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學設計n外在因素：試劑盒的運輸和貯存外在因素：試劑盒的運輸和貯存試劑盒的運輸和貯存試劑盒的運輸和貯存nPCR試劑盒

4、的有效期一般為6個月，這是指在適當的貯存溫度下。核酸擴增部分的試劑一般要貯存于-20下；產物檢測部分試劑則貯存于28。n試劑盒從廠家到用戶手中，均要經歷運輸及運輸中的貯存，任一環節的不當，均會影響試劑盒的臨床使用質量。PCRPCR試劑盒的分類試劑盒的分類n定性測定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交（雜交梳）、熒光PCR（分子信標和Taq Man等）n定量測定： PCR-ELISA 、Taq Man和Amplisensor熒光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。PCRPCR試劑盒的選用原則試劑盒的選用原則n參考試劑生產廠家的信息廣告n參考同行對有關試劑盒的使用效果n參考有關機

5、構的綜合評價n根據使用目的n根據所在實驗室的技術特點n根據所在醫院患者的承受能力PCRPCR試劑盒的質檢試劑盒的質檢n外包裝：廠家名稱、檢測目的、批準文號、批號和有效期等。n內包裝：試劑瓶是否漏液、真空包裝是否破損以、試劑是否齊全以及是否有使用說明書等。PCRPCR試劑盒的質檢試劑盒的質檢( (定性測定定性測定) )n性能質檢性能質檢n采用血清（樣本）盤（采用血清（樣本）盤（PanelPanel）質檢）質檢： PCR試劑血清（樣本）盤由一定數量的原血清陰、陽性樣本、23份純化核酸（DNA或RNA或cDNA）樣本以及35份系列稀釋陽性樣本所組成。樣本總數可定在20份左右。 n原血清樣本用于判斷試

6、劑盒對特定病原體核酸原血清樣本用于判斷試劑盒對特定病原體核酸檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣本用于判斷本用于判斷DNADNA擴增或逆轉錄及擴增或逆轉錄及DNADNA擴增的有效擴增的有效性；系列稀釋陽性樣本用于判斷試劑的測定下性；系列稀釋陽性樣本用于判斷試劑的測定下限。限。試劑特異性、靈敏度和符合率試劑特異性、靈敏度和符合率計計 算算 公公 式式試劑特異性、靈敏度和符合率試劑特異性、靈敏度和符合率計計 算算 公公 式式n靈敏度（） (a / a+c)100%n特異性（） (d/b+d) 100%n符合率（） (a+d/a+b+c+d) 100%PC

7、RPCR試劑盒的質檢試劑盒的質檢( (定量測定定量測定) )n樣本：已知濃度的高、中、低三種濃度質控物。n質檢內容：測定的重復性 測定范圍 抗干擾能力技術驗收依據：n臨床檢驗擴增檢驗實驗室管理暫行辦法 衛醫發200210號n臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范 衛檢字2002第8號技術驗收內容技術驗收內容n實驗室設置和設備n設施和環境n人員n設備管理n檢測方法n標本管理n記錄n報告n質量控制n抱怨 等十章共三十八條實驗室設置和設備實驗室設置和設備n本章共七條。 n實驗室分區：規范化分區、明確的識別標記n防污染：空氣流向、中央空調、各區間的封閉性n各區儀器設備物品配備：充分性、科學性、專用性（標識）

8、“生物安全柜生物安全柜” ” “ “可移動紫外燈可移動紫外燈” ” “ “加樣器加樣器”設施和環境設施和環境n本章包括五條；n實驗室設施、工作區域、能源、照明等；n環境和實驗條件控制設施：溫濕度計溫濕度計、不間斷不間斷或穩壓電源等或穩壓電源等；n實驗室進出的限制和控制：人員進入控制標識、生物傳染危險性標識n實驗室“內務管理”（如人員流動、清潔等）制度和相應設施；n廢棄血清處理、生物防護等措施和相應設施設施和環境需注意的問題設施和環境需注意的問題n清潔程序或制度 清潔用具的專用、清潔工作的單一流向、清潔用具的專用、清潔工作的單一流向、清潔方法的具體性清潔方法的具體性n生物防護及廢棄血清處理 對工

9、作人員工作人員的保護和對環境環境的保護 銳器銳器使用規則 生物傳染危險性廢棄物出實驗室前出實驗室前預處理人人 員員n本章包括三條。n人員數量足夠；有培訓上崗證n培訓計劃：室內的定期培訓（記錄）n人員技術（資格、培訓、技能）檔案。設備管理（設備管理（1 1）n本章包括三條。n主要儀器設備應得到正確維護，應有設備維護程序文件；以及維護的記錄n加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等設備應有校準程序文件、有明顯標識表明其校準狀態（此次校準時間及下次應校準時間）；n實驗室應保存每一臺儀器設備的檔案材料，對檔案材料的具體內容作了詳細規定。 設備和質控物（設備和質控物（2 2）n每一臺設備的檔案內容包括： （a）

10、設備名稱；（b）制造商名稱、型號、序號等；（c）接收日期和啟用日期；（d）目前放置地點；（e）接收時的狀態；（f）儀器使用說明書有復印件；（g）校準和/或檢定的日期和結果及下次校準和/或檢定的日期；（h）迄今所進行的維護和今后維護計劃的細節；（i）損壞、故障、改裝或修理的歷史。檢檢 測測 方方 法法n本章包括三條。n標準操作程序（SOP）：儀器設備操作和校準程序；標本收集處理程序；擴增檢測工作程序；儀器試劑的選購和質檢程序；消耗性材料的購買、驗收、質檢和貯存程序。nSOP應現行有效及便于使用。標 本 管 理n本章包括五條。n建立唯一編號識別系統，避免標本混淆；n標本采集、運送和保存程序；n標本

11、接收時的狀態記錄；n標本的適用性和充分性；n標本貯存的標準操作程序及貯存溫度控制措施;n標本接收及安全處置程序；n維護實驗室誠實性的必要措施。記記 錄錄n本章包括三條。n有記錄管理制度：適合自身實際情況，符合現行規章制度；（由誰管、在何處管、保存多長時間）n原始記錄、計算和導出數據應歸檔并保存；n記錄應有有關人員的簽字；n所有記錄和報告都要妥善保管并保密。報報 告告n檢測結果的報告應準確、清晰和客觀；n定性測定報告“陰性”或“陽性”；定量測定則以拷貝數/ml或IU/ ml報告；避免二者之間的混淆；n每份報告應包括以下信息：標題、唯一標識、檢測標本說明、標本特性和狀態、標本接收日期和檢測日期、檢測方法、檢測和校核人員簽字及發出日期、參考結果或范圍；n如對報告有效性有疑問，實驗室應立即通知臨床相關科室予以改正的程序；n有報告的發放程序：用電話、傳真、電子郵件報告結果時的保密原則。質質 量量 控控 制制n實驗室應有室內質量控制標準操作程序 質控物來源、濃度、批號 陰性質控的設置 所選擇的統計質控方法（均值、SD如何得到的） 失控的判斷標準 失控以后怎么辦n實驗室應參加室間質量評價。抱抱 怨怨n實驗室應制定抱怨及其處理