1、a-L-巖藻糖昔底物測定AFU的活的評估元升生物科技技術研發部1概述a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase, AFU)的分類名為a-L-巖藻糖甘酶水解酶 (EC3. 2. 1. 51),催化巖藻糖甘鍵水解，參與含巖藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋 白和糖脂的分解代謝。AFU合成于細胞內，定位于溶酶體，是一種酸性水解酶， 它的本質是糖蛋白。廣泛分布于人體肝、腎、胰、腦和胎盤等組織以及血清、尿液、唾液和淚液中。AFU在人體內呈多形性，在等電聚焦電泳中AFU可分出5 9條區帶，血清中AFU除含有PI為4. 68和4. 84兩種主要成分以外，還可見 到5個次要成分。AFU具有3型同工酶，即AFU1、

2、AFU2和AFU3 ,是由1個 位于第一號染色體短臂(1p34)上基因位點的2個等位基因所表達，由于不同人 所表達的同工酶類型不同，所以正常人群 AFU活性也有所不同，大約有10%左 右的正常人血漿AFU呈低活性。測定a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase,AFU)對診 斷原發性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)M有重要臨床意義。它是PHC的特 異性標志物，可用于PHC的早期診斷.2原理底物CNP-AFU在血清樣本中a-L-巖藻糖甘酶酶作用下，生成產物 CPNP,而產物 CPNP的生成量與樣本中AFU的酶活性成正比，通過測定黃色產物在 405nm波長

3、的生成速率，即可計算出樣本中AFU的活性。3實驗方法3.1 樣本 瑞安市人民醫院臨床新鮮血清樣品。3.2 儀器和試劑CNP-AFU元升生物科技生物科技有限公司生產，批號1213M05QH。進口底物購自美國sigm心司，批號1013c07QH;儀器為日立7080 全自動生化分析儀、抗壞血酸、膽紅素、人胎盤 a-L-巖藻糖甘酶均購自sigm宓 司，血紅蛋白標準品購自上海血液中心。3.3 試劑配制方法按常法配制，所用原料均為分析純。3.4 測定方法 HITACHI 7080自動分析儀參數反應類型：Rate-A法；反應溫度：37C；波長：（主）340/（次）405nm；樣本：25口 試齊1250口 讀

4、點時間6-12點0.05, y=0.9813X-0.3746;r=0.9991表明本試劑與進口 試劑高度相關。4.4 回收實驗向250仙血清中加入50仙的生理鹽水作為基礎樣本，測得 AFU濃度為20U/L ,向同體積的血清標本中分別加入 50仙濃度為25U/L和80U/L的AFU酶標準品， 使其終濃度分別為24.2U/L和33.3U/L的樣本，每一濃度作平行管，測得其回收率為 98.5% 102.4%.4.5 干擾試驗 在高、低兩個濃度的混合血清樣本中分別加入不同濃度的膽紅素、血 紅蛋白、抗壞血酸（MtC）,然合對AFU進行測定，結果表明三酰甘油0 5.0mmol/L、 Hb 膽紅素0 500

5、pmdL、MtC 0 10g/L時經配對差異比較，均無顯著干擾 （P0.05）。而常用抗凝劑中EDTA.K2、草酸鈉對檢測無顯著干擾，但肝素明顯干擾AFU 的檢測，使AFU結果出現假性偏高，其干擾機理尚不清楚。5結論本公司合成的CNP-AFU底物法用于檢測AFU活性較為理想，該底物在酸性條件 下，樣本中的AFU將含呈色基團的底物CNP-AFU的1, 4位糖昔鍵水解，使反應 在405nm處產生最大吸光度，通過測定吸光度的變化，即可計算出樣本中AFU的活性。我們對公司合成的該底物用于檢測 AFU酶活進行其主要指標的評價，具結 果顯示批內 CV 2.2% ,批問 CV 2.4%。三酰甘油0 5.0mmol/L、Hb 膽紅素W 500pmOL、V讓C010g/L時對結果無顯著性干擾（P0.05）;經與進口底 物配制的試劑比對其結果高度相關，完全能滿足臨床檢測要求。附產品檢測圖（HPLC）:CHP-AFU 51DC-似34陛常MS1: Suo ES+If?MB4/274.4536792 453 多僅sea34 467,a111111 I 11O.OT- 2.004.006.D00.0010.00120014.001