1、丙型肝炎病毒核酸定量分析的臨床意義【摘要】 目的 探討慢性丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)與病情及治療的關系。方法 應用美國AcuGen公司提供的定量PCR試劑盒，通過熒光檢測儀對50例丙型肝炎患者的血清HCV RNA作定量檢測。結果 50例患者血清HCV RNA均值為(100.0533.16)107拷貝/L，HCV RNA水平與ALT呈正相關(r=0.6867, P0.05)。有輸血史的患者HCV RNA水平明顯高于無輸血史者。HCV RNA血清水平低者對IFN-a反應較好。結論 HCV RNA定量檢測在一定程度上反映肝臟炎癥活動度及肝損害程度，有助于指導抗病毒治療。【關鍵

2、詞】 丙型肝炎病毒 定量分析 聚合酶鏈反應THE CLINICAL SIGNIFICANCE OF QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTION FOR HCV RNA IN PATIENTS WITH HEPATITIS C Zhang Lingxia, Ma Hongbing, Li Boan, et al. No. 302 Hospital PLA, Beijing 100039【Abstract】 Objective To evaluate the relationship between the serum level of HCV RNA and c

3、ondition of patients with chronic hepatitis C. Methods HCV RNA in serum of 50 patients with chronic hepatitis C (CHC) was determined by quantitative polymerase chain reaction(PCR). The kits were used from AcuGen Co. USA that were based on the principle of fluorescence energy transfer. Results The me

4、an HCV RNA level in serum of 50 patients with CHC was 100.0510733.16107. The serum level of HCV RNA was correlated with ALT level. Antiviral effect of IFN-a on a lower lever HCV RNA was better than that on a higher one. Conclusion The results show that quantitative PCR is of great value in evaluatin

5、g the degree of inflammative activity in liver and the efficacy of antiviral therapy. 【Key words】 HCV Quantitative analysis Polymerase chain reaction近年來，在聚合酶鏈反應(PCR)測定HCV RNA的基礎上，建立了數種丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)定量檢測的方法，從而對感染丙型肝炎病毒(HCV)后患者血清病毒水平消長與臨床表現的關系有了較深刻的認識。現對慢性丙型肝炎(丙肝)患者血清HCV RNA水平與輸血史、疾病類型、肝功能損害程度(ALT水

6、平)、治療等因素之間的關系作一探討。資料與方法一、對象選擇50例慢性丙型肝炎患者(按1995年全國病毒性肝炎會議標準診斷)，男41例，女19例，全部患者血清HCV RNA(+)，抗-HCV(+)，同時檢測了23例患者的基因型(型8例、型4例、+型11例)。其中19例伴肝硬化，15例伴HBsAg(+)，9例行肝活組織檢查。二、主要試劑HCV RNA定量PCR試劑盒由美國AcuGen公司提供，逆轉錄引物：5 CCTGGCAATTCCGG TGTACTC 3，產物為HCV RNA 5端非編碼基因；不對稱擴增引物：5 GAAAGCGTCTAGCCATG GCGTTAGTA 3，擴增產物為逆轉錄產物HC

7、V cRNA內長度211bp的片斷；熒光引物：5 CAGCCT CCAGGACCCCC 3，擴增產物為不對稱擴增產物內長度66bp的片斷。熒光檢測儀為美國產AG-9600型。方法：(1)患者血清100ml，采用二氧化硅吸附法提供RNA模板。(2)逆轉錄、不對稱擴增及熒光引物參與的擴增均按試劑盒說明書進行。(3)定量檢測：通過熒光檢測儀檢測各個反應體系的熒光強度，微機統計計算，根據試驗中設定的陰性對照、最大信號對照、5個不同量的HCV cDNA陽性標準對照的熒光強度變化算出待檢標本中HCV RNA的含量。抗-HCV、HCV RNA分型及ALT等肝功能指標由解放軍302醫院免疫研究室及檢驗中心完成

8、。三、統計學方法由SAS軟件完成，根據相關諸因素在回歸模型中作用大小，選取對HCV RNA水平影響有較大作用的因素：ALT，臨床診斷，輸血史等分別作分層量化分析。結 果一、血清HCV RNA定量檢測結果均值為(100.0533.16)107拷貝/L(范圍在1.011071 040.00107之間，以下107拷貝/L均略去)。二、血清HCV RNA與病情及治療的關系1. 血清HCV RNA滴度與ALT呈正相關(附表)，回歸系數(BC)=0.6837，P=0.0299。ALT151U/L(11例)組為303.93112.33(F=6.58，P=0.003)。2. 臨床診斷為慢性丙肝組HCV RNA

9、水平(139.0036.64)明顯高于伴有肝硬化組(14.0048.66)，(P0.05)。3. 病前有輸血史患者的HCV RNA水平(142.0035.41)明顯高于無輸血史者(12.0050.58)，(P0.05)。還觀察了血清HCV RNA水平與年齡、血清總膽紅素、HCV RNA基因型，病理改變，合并HBV感染等因素的關系，未發現兩者有相關性。討 論近幾年內發展起來的逆轉錄定量PCR技術，已逐漸應用于臨床核酸檢測，有助于了解在感染人群中，血清病毒水平。根據Hagiwara1、Lau2、Gretch3等采用定量PCR技術結果表明，HCV RNA血清水平越高，肝小葉炎癥活動程度越高，血清AL

10、T水平越高，提示血清病毒水平似可反應肝臟炎癥活動程度。上述結果與此一致。慢性丙肝患者HCV RNA水平之所以高于伴有肝硬化者，可能是因為前者均因ALT升高就診住院，后者則以并發癥住院，其肝臟炎癥活動則相對處于靜止狀態。HCV RNA定量檢測有助于預測、監測抗病毒治療的效果，Lau采用IFN-a2b治療慢性丙肝患者，獲完全應答、不完全應答和無反應三種療效，3組間差異非常顯著。應用IFN-a治療后轉陰組與未轉陰組的血清HCV RNA初始水平分別為31.02及124.30，但因例數太少，經統計學處理未見顯著差異。總之，HCV病毒核酸的定量檢測在一定程度上能反應肝臟炎癥活動程度；輸血后丙肝患者血清病毒

11、核酸水平高于非輸血性丙肝，這是輸血后丙肝病情偏重的原因之一；HCV定量檢測是考核抗病毒藥物療效的較好指標，分析抗病毒治療后HCV RNA血清水平有助于總結抗病毒制劑的療效，為調整劑量、確定療程提供依據。但是，定量RT-PCR檢測HCV RNA也受到一些因素如操作人員的技術水平差異等的影響，成本高(大于定性檢測)，敏感性不如巢式PCR等，因此應根據具體情況選擇應用。作者單位：100039北京，解放軍302醫院參 考 文 獻1 Hagiwara H, Mayashi N, Mita E, et al. Quantitation of HCV RNA in serum of asymptomatic

12、 blood donors and patients with type C chronic liver disease. Hepatology, 1993, 17: 545-550.2 Lau JYN, Davis GL, Kinffen J, et al. Significance of serum HCV RNA levels in CHC. Lancet, 1993, 341: 1501-1504.3 Gretch D, Corey L, Wilson J, et al. Assessment of HCV RNA levels by QC-PCR: hightiter viremia correlates with advanced stage of disease. J Infect Dis, 199