1、染料木素影響MRS糜白表達的差異性分析及相關耐藥蛋白介導細菌耐藥的機制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA足醫院感染中最常見的致病菌之一,由于廣泛且不合理的使用抗生素，MRSA勺耐藥性問題日益嚴重。已有的研究表明,MRSA勺主動外排系統和生物被膜的形成是導致其產生多重耐藥的主要原因。其中,主動外排系統和生物被膜的形成均與耐藥蛋白有關。本實驗室前期研究結果也證明,染料木素中藥單體化合物能顯著抑制MRSAS白的表達量,由此推測其對MRS的抑制作用與蛋白有關，但關于染料木素作用MRS府，菌體蛋白的變化尚不清楚。因此，本文通過iTRAQ技術檢測了染料木素作用MRS質菌體蛋白表達量的變化;并通過生物信息學

2、分析方法,對差異顯著的蛋白在分子功能、生物學進程、所處細胞位置以及所參與的通路等方面的差異進行系統的分析,進而探討了耐藥相關蛋白在介導細菌耐藥方面的作用機制。具體的研究結果如下:(1)通過iTRAQ技術，檢測染料木素作用MRSAI菌體蛋白的表達差異。實驗結果顯示,樣品共檢測到1312個蛋白,與對照組相比,差異顯著蛋白共有129個,包括60個表達上調的蛋白和69個表達下調的蛋白;(2)通過qRT-PCR法，檢測了差異顯著的上調蛋白和下調蛋白的基因表達水平,以驗證iTRAQ檢測結果的準確性。實驗結果顯示,與對照組相比,下調蛋白PstB和PstC中的mRNA表達水平明顯降低,其基因表達量分別下降了5

3、1.6%和52.1%(P<0.01);上調蛋白SecYMip和RecT的mRNA勺表達量顯著性增加，與對照組相比，分別增加了77.2%、87.5%和90.1%(P<0.01)。基因表達水平與蛋白表達水平的變化趨勢完全一致，表明本研究的iTRAQ檢測結果準確, 可用于后續的生物信息學分析。通過GO KEG住口 String 方法,對染料木素作用MRSA1差異顯著蛋白表達的差異性進行生物信息學分析。1)GO分析結果顯示,所檢測到的129個顯著性差異蛋白，主要參與10種生物學過程,按照基因所占比例的高低,這些差異顯著蛋白分別參與代謝(80%),細胞(65%)和單有機體(5

4、8%)等過程;主要分布在細胞(46%),細胞組分(44%),細胞膜(22%)等位置；分別執行催化(63%),結合(44%)和轉運(10%)等功能。2)KEGGffi路數據庫分析結果顯示,所檢測的129個差異顯著蛋白,參與的通路主要包括四大類,分別是代謝通路、遺傳信息處理通路、環境信息處理通路和一些未知的通路。其中,代謝通路所包含的差異蛋白數量有50個;遺傳信息處理通路有17個;環境信息處理通路所包含的差異蛋白有17個;其他19個差異蛋白參與的通路尚不清楚。3)String分析結果顯示,129個差異顯著蛋白之間存在直接和間接的相互作用。有的差異蛋白連接密集,有的連接松散。其中,secY、rpsE

5、、isaB和PstB等蛋白與其它蛋白的相互作用關系5,它們是蛋白質相互作用網絡的中心節點，在蛋白轉運、核糖體合成、細胞免疫以及細菌耐藥方面發揮重要作用。(4)對檢測出的129個差異顯著蛋白,通過分析其分子功能,得到與耐藥相關的蛋白,并對其介導細菌耐藥的機制進行了探討。結果顯示,與細菌耐藥相關的蛋白約有14個，其中,PstB、PstC和PhoU等蛋白主要是通過主動外排系統介導細菌耐藥;PstS、altA和sarR等蛋白主要通過促進細菌生物被膜的形成介導細菌耐藥。(5)利用蓄積動力學實驗、結晶紫半定量法和qRT-PCRfe對PstB和PstS蛋白介導細菌耐藥的機制進行了驗證。1)蓄積動力學結果顯示

6、,Pst系統抑制劑維拉帕米作用MRSA4157菌體后，與對照組相比，菌體內環內沙星的蓄積量明顯升高。其中,100?g/ml的維拉帕米作用菌體12min后,環丙沙星的蓄積量比空白對照組增加了32%(P<0.01)。由于PstB是外排泵的組成蛋白,表明維拉帕米逆轉細菌耐藥可能與抑制PstB蛋白的表達有關。qRT-PCR吉果顯示，維拉帕米能抑制pstB基因的表達量。與對照組相比，100Ng/ml維拉帕米作用MRSA41577體16h后,pstB基因的表達量降低了89%(P<0.01)。表明維拉帕米可通過抑制pstB的mRNAfe達量來逆轉MRSA4157耐藥。2)結晶紫半定量結果顯示，維拉帕米對MRSA4157生物被膜的形成和成熟的生物被膜均有一定的抑制作用。與對照組相比，100Ng/ml的維拉帕米可使游離細菌和成熟生物被膜內細菌的數量均減少約25%(P<0.05)。qRT-PCR吉果顯示，維拉帕米能抑制pstSmRNA的表達量。與對照組相比，100仙