1、蛋白表達的亞細胞定位影響基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平     蛋白表達的亞細胞定位影響基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平#楊軍1，陳曉黎1，王一理2，司履生2*基金項目：教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃（編號：NCET-10-0647）.作者簡介：楊軍，（1972-），男，副教授，腫瘤病理學(xué). E-mail:  85 1.2 方法1.2.1 重組pcDNA 真核表達載體的構(gòu)建利用PCR 技術(shù)，用P1 和P4 引物從pFB-EGFP-HPV16L1 質(zhì)粒中擴增EGFP-HPV16L1融合基因片段，用P1 和P5 引物從pFB-EGFP-HPV16

2、L1NLS 質(zhì)粒中擴增截斷型EGFP-HPV16L1NLS 融合基因片段(刪除編碼HPV16 L1 核定位序列的核苷酸片段144790 1518bp)，并分被將其插入pcDNA3.1(+)真核表達載體多克隆酶切位點EcoR 和Xho之間得到pcDNA-EGFP-HPV16L1 和pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 重組表達載體；以上重組載體均經(jīng)雙酶切、PCR 及基因測序證實構(gòu)建正確。用Qiagen tip500 進行質(zhì)粒的提取和純化。紫外分光光度計測定質(zhì)粒的A260 和A280，進行DNA 定量，終濃度調(diào)節(jié)至100g/l。同法制備pcDNA3 空質(zhì)粒DNA 作為對照。（圖1）95圖1

3、重組pcDNA 真核表達載體的構(gòu)建模式圖Fig 1 Schematic maps of expression plasmid with insert of EGFP tagged various deletion mutants of HPV16L1gene: (A) pcDNA-EGFP-HPV16L1 plamid expressing a fusion EGFP-HPV16L1 proteins with NLS of HPV16L1;(B) pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS plasmid expressing a fusion EGFP-HPV16L1NLS protein

4、 without NLS of100 HPV16L1.1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 細胞用含10% 胎牛血清的RP2MI1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO 細胞。于轉(zhuǎn)染前18 h , 將處于對數(shù)增長期的CHO 細胞, 以Trypsin (2.5g/L)2EDTA(1mmol/L) 消化傳代。將CHO 細胞均105 按每孔約為2 ×105個細胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，至細胞密度大約為60%時, 配置以下溶液：A 液(5l 重組的pcDNA 質(zhì)粒加入95l 滅菌去離子水) 與B 液（6l Cellfectin 加入94l 滅菌去離子水）輕輕混勻，室溫放置30min；用無血清、無抗生素的RPM

5、I1640 培養(yǎng)基洗滌細胞3 次后，逐滴加入AB 混合液，培養(yǎng)10h 后更換完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 天（具體方法參照invitrogen 公司cellfectin 操作手冊）。倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP 標記的融合蛋白的表達。110 1.2.3 重組質(zhì)粒免疫動物選擇6 8 周齡雌性BALB/c 小鼠,隨機分為3 組,每組6 只。分別為組:pcDNA-EGFP-HPV16L 質(zhì)粒免疫組,組: pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 質(zhì)粒免疫組,組:pcDNA3. 1(100l/鼠)空質(zhì)粒免疫組，進行雙側(cè)股四頭肌肌肉注射免疫。用0.25%布比卡因（50l/只）行雙側(cè)股四頭肌肌肉注射以提高肌肉攝取

6、質(zhì)粒DNA 的能力, 72h 后開始免疫,115 DNA 量為每側(cè)肢體100 g, 每只鼠總量200g。間隔2 周免疫一次, 共3 次。每次免疫前尾靜脈采血，末次免疫后第14 天眼球后取血并脫頸處死動物。 1.2.4 ELISA 法檢測血清抗體在35mm 培養(yǎng)皿中27 Grace's 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)Sf9 細胞至80%融合時，更換含2胎牛血清的Grace's 培養(yǎng)液，加入400l 重組EGFP 桿狀病毒共培養(yǎng)72h 收集培養(yǎng)上清，倒置熒光顯微鏡觀察EGFP 的表達，用ProBondTM 120 Column 樹脂（Invitrogen 公司）非變性法純化EGFP 蛋白

7、，（具體方法參照GIBCO 公司Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統(tǒng)操作手冊），并蛋白定量。包被96 孔酶標，每孔加EGFP 蛋白0.1g，置濕盒中，37，1，4過夜；5%脫脂奶封閉, 37，2;抗血清1:100 稀釋倍后，100/孔加入抗原孔，每份樣品均設(shè)3個平行樣，同時設(shè)空白組。37，孵育2，TBST 洗板，3×5min；加入1:5000 稀釋的羊125 抗鼠二抗（IgG-HRP）100l，37孵育1, TBST 洗板，3×5min；加入底物液100顯色，1mol H2SO4 終止反應(yīng)。酶標自動分析儀450nm 波長測其吸光度（A 值），比較組間A值的差異。1.2.5

8、 統(tǒng)計方法 t 檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析2 結(jié)果130 2.1 重組pFast-Bac 輔助表達載體的構(gòu)建1%瓊脂糖電泳檢測，重組pcDNA-EGFP-HPV16L1 和pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 真核表達載體，大小與理論值一致（圖2）。PCR 及雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)重組pcDNA3.1 表達載體構(gòu)建成功。135圖2 PCR法鑒定重組pcDNA-EGFP-HPV16L1和pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS質(zhì)粒Fig 2. Identification of recombinant pcDNA-EGFP-HPV16L1, pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS plasmids

9、by PCR.EGFP genes were amplified by PCR using P1 and P2 primers from pcDNA-EGFP-HPV16L1 plasmid (1),pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS plasmid (2) , pcDNA3.1 plasmid (3); EGFP-HPV16L1NLS genes were140 amplified by PCR using P1 and P5 primers from pcDNA-EGFP-HPV16L1 plasmid (4), pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS plasmid (5)

10、, pcDNA3.1 plasmid (6); HPV16L1 genes were amplified by PCR using P3 and P4 primersfrom pcDNA-EGFP-HPV16L1 plasmid (7), pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS plasmid (8) , pcDNA3.1 plasmid (9);M：DNA marker.145 2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 細胞用重組pcDNA-EGFP-HPV16L1 和pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 真核表達載體轉(zhuǎn)染CHO 細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：在重組pcDNA-EGFP-HPV

11、16L1 真核表達載體轉(zhuǎn)染的CHO 細胞內(nèi)，綠色熒光集中于細胞核內(nèi)；而在重組pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 真核表達載體轉(zhuǎn)染的CHO 細胞內(nèi)，綠色熒光滯留于細胞漿內(nèi)，CHO 細胞核內(nèi)無綠色熒光。 150圖3 重組pcDNA-EGFP-HPV16L1和pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS質(zhì)粒在CHO細胞中的表達Fig 3. Photographic images of CHO cells transfected with indicated expression vectors pcDNA-EGFP-HPV16L1and pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS f

12、or EGFP-HPV16L1 and truncated EGFP-HPV16L1NLS proteins. Theintracellular localization of the EGFP fluorescence was visualized by fluorescence microscopy. (A)155 EGFP-HPV16L1 protein can be concentrated in the nuclear of CHO cells; (B) EGFP-HPV16L1NLS can belocation in the cytoplasm of CHO cells.2.3

13、ELISA 法檢測血清抗體ELISA 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用重組pcDNA3.1 真核表達載體免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性160 IgG 抗體，且用酶標儀450nm 波長檢測其抗體吸光度發(fā)現(xiàn)，隨著免疫次數(shù)的增加，血清抗體吸光度隨之升高，同時，免疫3 次之后，重組pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 真核表達載體免疫組小鼠血清IgG 吸光度顯著高于重組pcDNA-EGFP-HPV16L 真核表達載體免疫組小鼠血清IgG 吸光度（P<0.001）（Fig 2）。00.20.40.60.811.21.41.61.81 2 3 4groupsA450pcDNA-EGFP-HPV16L1NLSpc

14、DNA-EGFP-HPV16L1pcDNA3.1165 圖4 重組ELISA分析pcDNA3.1誘發(fā)的特異性IgG抗體水平（5%誤差線）Fig 4: anlalysis the level of specifi IgG antibodies in dera from immunized with recombinant pcDNA3.1 plasmidsby ELISA (5% error line)3 討論170 DNA 疫苗在宿主體內(nèi)表達的過程與自然過程相似，以自然的形式被加工，并以天然構(gòu)象提呈給宿主的免疫識別系統(tǒng)，這種蛋白的空間結(jié)構(gòu)接近天然構(gòu)型，抗原性強，且不存在抗原表位改變或丟失的情況

15、以及蛋白純化的問題，同時，DNA 疫苗具有免疫原的單一性，只有編碼所需抗原的基因被導(dǎo)入細胞得到表達，才能增強特異性免疫應(yīng)答，在很大程度上降低了非特異性免疫應(yīng)答的發(fā)生。此外，以DNA 直接免疫，能長時間誘導(dǎo)機體的免疫應(yīng)答等很175 多優(yōu)點。但是，雖然DNA 疫苗能高效誘導(dǎo)或產(chǎn)生功能性CD8+CTL 應(yīng)答，但通常只能誘導(dǎo) 微弱的體液免疫應(yīng)答。因此，提高DNA 免疫誘導(dǎo)的體液免疫水平具有重要要意義。人乳頭瘤病毒16 型 L1 蛋白（human papillomavirus 16 type L1 protein，HPV16 L1）是HPV16 衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其羧基端具有2 個經(jīng)典的NL

16、S：單組分NLS (499KRKKRK) 和包含單組分NLS 的雙組分NLS(484KRKatpttsststta499KRKKRK) 11，在HPV 生命周期中L1180 蛋白先后兩次被轉(zhuǎn)運入細胞核內(nèi)參與病毒的成功感染和子代病毒的順利組裝9,10，其所誘導(dǎo)的中和抗體對HPV16 感染具有保護作用。因此，研究L1 蛋白對DNA 疫苗所誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平的影響、制備抗L1 蛋白的特異性抗體對于HPV 的預(yù)防具有重要意義。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)和熒光技術(shù)，分別獲得增強型綠色熒光蛋白（enhance greenflurenscent protein, EGFP）基因12,13,14標記的全長H

17、PV16L1 基因（包含HPV16L1 NLS）和185 刪除HPV16L1 基因3'端包含完整NLS 的69bp（14471518bp）的截短型HPV16L1nsl基因， 并將其重組入pcDNA3.1 真核表達載體， 獲得pcDNA-EGFP-HPV16L1 和pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 重組真核表達載體。由重組pcDNA-EGFP-HPV16L1 真核表達載體表達的攜帶NLS 的EGFP-HPV16L1 融合蛋白能在被表達之后順利轉(zhuǎn)運入CHO 細胞的細胞核內(nèi)，而由重組pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 真核表達載體表達的刪除HPV16L1190 NLS 的截

18、短型EGFP-HPV16L1nsl 融合蛋白在被表達之后一直滯留于CHO 細胞胞漿內(nèi)，說明HPV16L1 NLS 具有核定位功能，且NLS 決定了表達產(chǎn)物的最終亞細胞定位。本研究采用肌肉注射方式分別將pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 重組真核表達載體注射入小鼠股四頭肌內(nèi)，并用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的EGFP蛋白作為抗原包被酶標本，通過ELISA 方法檢測IgG 抗體A450 吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然195 上述兩種重組真核表達載體均可誘發(fā)機體體液應(yīng)答反應(yīng)，但重組pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS 真核表達載體所誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平顯著高于重組pcDNA-EGFP-HPV16L1 真核表達載體所誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平（P0.01）。4 結(jié)論可見，具有相似氨基酸組成和蛋白結(jié)構(gòu)的蛋白產(chǎn)物，由于表達后蛋白產(chǎn)物的不同亞細胞200 定位可對基因免疫誘導(dǎo)的體液