1、    猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重組 和突變克隆的轉染研究        【 摘要 】目的研究猴免疫缺陷病毒(SIV)外膜糖蛋白(envGP)基因片段與病毒復制功能的關系。 方法利用兩病毒株共有的內切酶位點，將非致病性SIVmac 142株envGP區的DNA片段與致病性SIVmac 239株的對應區域進行置換，構成多個重組體。RFLP和部分序列測序確定后，用等量突變病毒(3g)轉染CD4+T淋巴細胞CEM×174細胞系，用ELISA監測培養液中S

2、IV核心蛋白P27水平的變化，以判定重組病毒的復制能力。 結果與SIVmac 239株相比，SIVmac 239 envGP重組體(SIVmac142/239 envGP/142)仍保持高度的復制活性，SIVmac239gp41(SIVmac142/239gp41/142)或SIVmac239N-gp41(SIVmac142/239N-gp41/142)的復制能力明顯降低，而SIVmac239C-gp41(SIVmac142/239C-gp41/142)重組體無復制活性。 結論envGP基因是SIVmac239株復制能力或毒力的重要調節因素。【 主題詞 】猴免疫缺陷病毒； 外膜糖蛋白； 重組；

3、 轉染； 病毒復制 Sequential recombination of SIV envelope protein (ENV) gene and study on transfection by the mutant clonesLIU Xiaomin, XU Ying, PAN Shangha（Laboratory of Molecular Biology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, P.R.China）【 Abstract 】ObjectiveTo study th

4、e relationship between DNA fragments in ENV gene of SIVmac and viral replicating ability. Methods Reciprocal recombinants were constructed by replacing the clonable DNA fragments of ENV region of the nonpathogenic SIVmac142 clone with the pathogenic SIVmac 239 clone. Following confirmation by RFLP a

5、nd partial sequence analysis, the aliquot mutant viruses (3g) were used to transfect CEM×174 cell line, and the concentration of SIVmac main core protein(P27) in culture supernatants was closely monitored by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to identify the replicating ability

6、of the mutants. ResultsCompared with SIVmac 239 clone, SIVmac 239 envGP recombinant (SIVmac142/239envGP/142) was still imbued with high replicating activity; and SIVmac239gp41 (SIVmac142/239gp41/142) or SIVmac239N-gp41 (SIVmac142/239N-gp41/142) with comparably decreasing activity, while SIVmac239C-g

7、p41(SIVmac142/239C-gp41/142) lacked replicating activity. ConclusionENV is an important regulating element to the replication or virulence of SIVmac239 clone.【 Subject words 】SIV; ENV; Recombination; Transfection; Viral replication猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency viruses SIV)是一組在致病性和毒力方面具有多樣性的靈長類動物病毒

8、，其中，SIVmac239克隆感染的猴表現為與人類AIDS相似的疾病，稱之為致病（或有毒）株，而SIVmac142克隆僅引起猴發生病毒血癥，不發生臨床綜合征，稱之為非致病（或無毒）株1。一般認為，外膜糖蛋白(envGP)在病毒的感染和免疫中起重要作用，而SIVmac239和SIVmac142克隆之間envGP區核苷酸的差別，是否提示SIVmac239克隆的致病性或毒力與envGP全區、部分或個別核苷酸有關，仍需要進一步研究2，3。本研究根據SIV基因組的內切酶譜，用致病性SIVmac239克隆的相應片段與非致病性SIVmac142克隆的envGP全區、gp41、N-gp41或C-gp41區進行

9、置換，并采用SIV基因組中Gag基因的產物SIV主要核心蛋白P27為指標，對重組病毒轉染CD4+T淋巴細胞CEM×174細胞后的復制能力進行測定和比較。材料和方法主要試劑：限制性內切酶和T4連接酶(New England Bio-Lab)，感受態細胞和CEM×174細胞(Stratagene)，DNA序列分析試劑盒(USB)，35S -dATP(Amershan)，DNA純化試劑盒(Bio101)，質粒PBS-SIVmac239半病毒克隆(P239-5，P239-3)和PBS-SIVmac142半病毒克隆(P142-5，P142-3)由New England提供，SIV核心

10、抗原P27酶聯免疫分析試劑盒由美國馬里蘭大學免疫微生物系贈送。1P239-3和P142-3克隆間重組體構建示意Fig 1. Schematic construction of recombinants between P239-3 and P142-3 clone*: Unique Nhe site in LTR of P142-3 cloneRegional Primate Research Center半病毒重組體的構建：分別對P239-3和P142-3半病毒克隆進行完全或部分酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離并收集envGP區相應的片段，Na-glassmilk法純化，將P239-3中的envGP

11、區全段，gp41區，N-gp41區或C-gp41區分別與P142-3 envGP區的相應片段互換，轉化后，利用IPTG、X-gal和抗菌素雙重篩選重組的半病毒克隆。酶切和測序鑒定：利用Nhe等內切酶，對重組體進行RFLP分析。采用雙脫氧末端終止法測定克隆點交界區DNA序列，證實重組片段的正確性。重組病毒的構建：將經測序確定的重組體分別與SIVmac142-5半病毒克隆(P142-5)經Sph切點連接，形成完整的病毒重組體。轉染試驗：采用DEAE-dextran轉染方法，用等量的重組病毒DNA(3g)分別轉染CEM×174細胞，其過程按文獻4方法進行。酶聯免疫分析：每隔3d連續多次收集

12、轉染后細胞培養介質，ELISA法測定SIV核心抗原P27的濃度，方法步驟大致同文獻5。結果1.SIVmac239-142重組體的構建：根據SIVmac142和239株基因組的核苷酸序列譜，在兩病毒envGP區的特定部位含有相同的內切酶位點，可以進行DNA片段的互換和克隆，在完全或不完全酶切后，電泳分離、收集、純化所需的片段，用P239-3的envGP(Sph-Sac，64509230，2.78kb)、gp41(Ban-Sac，81709230，1.06kb)、N-gp41(Ban-Nhe，81708750，0.58kb)或C-gp41(Nhe-Sac，87509230，0.48kb)分別替換P

13、142-3的相對應片段，經轉化、篩選、形成重組的半病毒克隆（1）。重組的半病毒克隆經Sph切點與SIVmac142-5相連形成4種完整的病毒重組體。包括：SIVmac239envGP(SIVmac142/239envGP/142)，SIVmac239gp41(SIVmac142/239gp41/142)，SIVmac239N-gp41(SIVmac142/239N-gp41/142)和SIVmac239C-gp41(SIVmac142/239C-gp41/142)。2.酶切、測序鑒定重組體：根據P142-3區長末端重復區(LTR)獨具另一Nhe切點(9309)的特性，對重組的半病毒克隆進行Sp

14、h+Nhe酶切分析，電泳顯示一約1.1kb的特異片段(82379309)，證實重組體3端下游LTR區為SIVmac142序列（2）。根據克隆點上、下游核苷序列設計引物如下：P1：5-ATCACTCCAATTGGCTTGGC-3(8109-8128)P2：5-GAATAGCTGGGATGTGTT-3(8621-8638)P3：5-GACAAGGGCTTGAGCTCACT-3(9217-9236)采用雙脫氧末端終止法測定重組體內239-142交界區的DNA序列，證實重組序列的正確性。3.轉染后SIVmac核心抗原(P27)的動態分析：用ELISA方法測定重組病毒轉染后培養液中SIVmac主要核心蛋

15、白P27的濃度及其動態演變，以推測病毒復制能力的變化。結果顯示：與SIVmac239株相比，SIVmac239envGP的復制能力無明顯差異，而克隆轉染后P27水平明顯下降，但于轉染后1821d時仍可達到試劑盒方法所界定的陽性復制水平(0.40ng/ml，見表1)5。SIVmac239C-gp41克隆與SIVmac142克隆一樣，在轉染后CEM×174細胞系中不具有復制活性（表1）。 2Sph、Nhe分析SIV半病毒重組體(P239envGP)Fig 2. Identification of SIV half virus recombinant(P239envGP) by Sph+N

16、heLane 1,2,3,4,5: P239envGP after Sph+Nhe digestion; Lane 6: -Hind DNA marker; Lane 7,8,9,10,11: P239envGP after Sphcomplete and Nhepartial digestionA: 1.1kb special fragment of Nhe-Nhe(82378309)B: 4.8kb fragement for P239C-gp41 cloning(reference Fig. 1)SIVmac239gp41或N-gp41 討論SIV與人類免疫缺陷病毒(HIV)是在進化上高

17、度同源、在致病性上非常相似的靈長類病毒。對SIV的研究是人類探索AIDS病因、發病機制、治療和預防的重要模型。SIV的envGP基因(gp160)主要由gp120和gp41兩個區域構成，gp41拷貝轉膜蛋白(TMP)，其分子結構的改變與SIVmac在人類細胞中的復制力不同有關6。在SIVmac239和SIVmac142兩克隆之間，envGP區域核苷酸組成的差異和分布與envGP的功能或與病毒致病性的關系目前尚不清楚。P27是由SIV基因組中Gag基因拷貝的SIV主要核心蛋白(main core protein)。一般認為，Gag基因及其產物與envGP 、Pol和LTR等共同參與調節病毒的感染

18、和復制過程。研究表明，SIV感染的猴從急性期存活的現象看與病毒復制的降調節有關，同時伴有針對SIV envGP和Gag蛋白抗體的產生7。用酶聯免疫法(ELISA)測定病毒原液、血漿或細胞培養介質中Gag蛋白P27(core protein P27)的濃度，具有使標本微型化，更簡單經濟等特點。且測定液中P27濃度與游離病毒的含量具有良好的一致性，它優于其它更間接測定SIV復制水平的方法，是一種敏感的量化指標5,7,8。本研究利用兩種病毒克隆envGP區DNA片段的可互換性，成功地建立了SIVmac142239之間的多項重組體并進行了體外轉染試驗。在轉染后，全envGP區重組體(SIVmac239

19、envGP)具有較強的復制活性；SIVmac239gp41克隆或SIVmac239N-gp41克隆的復制能力明顯低于前者；而SIVmac239C-gp41克隆不具有復制能力。與國外同類研究相似，本研究結果提示，SIVmac239envGP基因區的組成和完整性與SIV的復制能力（或毒力）有關8-10。此外，多項重組體轉染結果提示，envGP基因中N-gp41和gp120區域的核苷酸結構對維系envGP的功能更顯重要。SIVmac239C-gp41克隆在轉染后不具備復制活性，尚不能被清楚解釋，是否間接提示N端gp41區的某些或個別核苷酸與病毒的復制力或毒力有關，需要PCR誘導突變等進一步研究。表1

20、免疫熒光法測定轉染后培養液中SIV核心蛋白P27的濃度Table 1. Measurement of SIV core protein P27 in transfected culture medium by ELISASIV or recombinantSIV core protein P27Identificationof result#day3day6day9day12day15day18day21day24day27SIVmac2390.040.442.452.101.310.531.871.801.60(+)(150)*(1100)(1100)(1100)(1100)(1100)(1

21、100)SIVmac1420.040.040.030.020.020.050.010.090.07(-)SIVmac239envGP0.040.031.361.751.711.301.250.21(+)(1100)(1100)(1100)(1100)(1100)SIVmac239gp410.020.020.010.010.020.472.480.410.31(+)SIVmac239N-gp410.050.050.060.090.180.801.20(+)SIVmac239C-gp410.040.040.030.040.030.020.030.100.04(-) Wavelength 450-5

22、70nm, blank subtracted* Ratio of dilution with RPMI 1640# The point for positive level is above 0.40ng/ml 基金項目：國家教委留學歸國人員基金資助項目劉曉民（哈爾濱醫科大學第一醫院分子生物室）徐瑩（哈爾濱醫科大學第一醫院分子生物室）潘尚哈（哈爾濱醫科大學第一醫院分子生物室）畢麗（哈爾濱醫科大學第一醫院分子生物室）李言（美國馬里蘭大學免疫微生物系）參考文獻1，Hirsch VM, Johnson PR. Pathogenic diversity of simian immunodeficien

23、cy viruses. Virus Res, 1994, 32:183-203.2，Sakai H, Sakuragi S, Sakuragi J, et al. Sequence responsible for efficient replication of SIV、SIVmnd in cell of the monocyte/macrophage lineage. J GenVirol, 1992，73：2989-2993.3，Regier DA, Desrosiers RC. The complete nucleotide sequence of a pathogenic molecu

24、lar clone of simian immunodeficiency virus. AIDS Res Hum Retroviruses, 1990, 6(11):1221-1231.4，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.5，Lohman BL, Higgins J, Marthas ML, et al. Development of SIV isolation titration and neutralization assay which use whole blood from rhesus monkeys and a antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microl, 1991, 29:2187-219