1、轉染融合基因的DC抗腫瘤免疫效應         08-06-10 11:32:00     編輯：studa20           作者：張文彬 張海紅 孔維 查曉 陳廷清 鄧碧芳 任原 黃建鳴【摘要】  目的研究轉染融合基因（GMCSFsurvivin GMSur）的樹突狀細胞(DC)在體外誘導高效而特異的抗腫瘤免疫效應。方法用jetPEITMMacrophag

2、e轉染體系，將構建的GMSur融合基因轉染入DC，用流式細胞儀檢測DC的表面分子HLADR、CD83、CD80、CD86 表達的高低;用LDH法測定轉染融合基因的DC誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)殺傷腫瘤細胞（HT29和OVCAR3）的能力。結果轉染融合基因的DC細胞中可檢測到GMSur融合蛋白的表達；DC表面高表達HLADR、CD83、CD80、CD86；PHA/rhIL2長期培養（21d）的T細胞CD8+比例明顯增加；轉染融合基因的DC對HT29腫瘤細胞的殺傷率顯著高于未修飾的DC的殺傷率。結論GMSur基因轉染修飾的DC能選擇性誘導MHCI類分子限制的CTL的特異性，顯著提高D

3、C的抗原提呈功能和誘導高效而特異的抗腫瘤免疫效應。 【關鍵詞】  腫瘤; 樹突狀細胞; 融合基因; CTL；survivin；Abstract：Objective To study the specific antitumor immunological effects induced by dendritic cells transfected with GMCSF gene and survivin gene(GMSur) in vitro. MethodspcDNA 3.1 plasmid containing GMSur fusion gene was constructed

4、 and was transfected into dendritic cells by jetPEITMMcrophage transfected kit; cellular surface phenotype such as CD1a, CD80, CD86, CD83 were detected by FACS; The specific cytotoxicity of induced human cytotoxic T lymphocyte (CTLs) to tumor cells was detected with LDH assay. ResultsGMSur expressio

5、n was detected in DC cells; Highlevel expression of HLADR, CD1a, CD80, CD86, CD83 were found in transeneed DC cells; The ratio of CD8+   cells cultured with PHA/rhIL2 were largely increased. The lyse rate of induced CTL cells to HT29 cell were much higher than those of blank DC cells.Concl

6、usionGMSur gene modified DC cells could induce MHCspecific cytotoxic T lymphocytes and strikingly raised DC cell,s antigen present function and could induce high effective and specific anticancer immunological effect.   Key words：Tumor；Dendritic cell; Fusion Gene; CTL; survivin0引言surv

7、ivin基因是一種新的抗凋亡基因， 廣泛表達于人的胚胎發育組織,在正常成人組織中不表達， 但在大多數腫瘤組織中表達,對腫瘤的發生、 發展起著重要作用， 是一個較為特異的腫瘤相關抗原（Tumorassociated antigen， TAA）基因1。 樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）是體內重要的專職抗原提呈細胞， 直接啟動和調控機體特異性的抗腫瘤免疫應答2。  粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）對DC的增殖分化、 細胞活力以及抗原提呈功能有著重要的調節作用3。 我們構建的GMCSFsurvivin融合基因表達質粒（pcGMSur）并轉染人外周血來源誘導擴增的樹突狀

8、細胞， 探討轉染后DC的生物學特性及誘導產生的抗腫瘤免疫效應。1材料與方法1.1主要試劑pcDNA3.1(-)購自invitrogen公司。HT29細胞株、GMCSF基因由四川康龍生物醫學有限公司惠贈。survivin基因由本科室從HT29細胞中克隆獲得，經DNA測序與GenBank上收載的survivin序列一致。各種限制性內切酶、連接酶購自TaKaRa公司。LDH細胞毒分析盒（Cytotox96）購于Promega公司；jetPEITMMacrophage轉染體系購自polyplustransfection公司、人白細胞介素4（IL4）、GMCSF購自晶美生物公司。CD1a、CD80、CD

9、83、CD86、HLADR單抗由華西醫院腫瘤生物實驗室提供。1.2GMCSF與survivin基因的連接以GMCSF基因DNA為模板，pGM1、pGM127為引物進行PCR擴增。以survivin為模板，Psur01、Psur02為引物進行PCR擴增。擴增DNA純化后，BamHI內切酶37酶切2h，37 15min熱終止反應，反應物純化后加入T4DNA ligase，16連接18h。GMCSF與缺失八個氨基端氨基酸的survivin之間加入一段含三個重復氨基酸殘基序列為GGGGS的肽段。利用氨基酸密碼的同義突變，在連接子堿基序列的中間位置形成一個BamHI內切位點。1.3pcGMSur質粒構建

10、以上述連接物為模板，pGM1、pSur02為引物，反應條件同。反應物經純化后，分別經EcoRI、Hind酶切。質粒pcDNA3.1(-)DNA經同樣處理。酶切后純化DNA并定量。取酶切后純化的GMCSFsurvivin DNA  5g，pcDNA3.1(-)質粒DNA  1g，10U T4 DNA ligase，反應體系為20l。16保溫20h。取連接產物10l轉化感受態大腸桿菌DH52。接種氨芐青霉素平板。挑取克隆擴增培養，提取質粒，經PCR擴增初步獲得pcGMSur陽性質粒。質粒經酶切電泳鑒定。  PGM1：5GCGAATTCTAGACATGGCACCCGCC

11、CGCTCGCCC3,PGM127：5CCGGATCCACCGCCACCACTCCCTCCGCCACCCTCCTGGACTGGCTC3; Psur01：5GAGGATCCGGTGGCGGAGGGAGTGGCGCCTGGCAGCCCCTTTCTC3，Psur02：5GGAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAGCTG3。1.4DC的誘導擴增采集健康自愿者外周血，肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離，收集單個核細胞層，用含20% NCS(小牛血清)的RPMI1640培養液調細胞濃度為2×106/ml，制成細胞懸液。取1ml接種與24孔板中，于5%  CO2、37孵育2h后，吸出

12、未貼壁的細胞備用。補加少許20%  NCS RPMI1640使GMCSF（1500ng/ml）和IL4（5000U/ml），終濃度分別為150ng/ml和500U/ml，置于5%  CO2、37培養，每隔一天半量換液，至第7d收集DC。分別用CD1a、CD80、CD83、CD86、HLADR單抗標記，流式細胞儀鑒定細胞表型。1.5pGMSur轉染DC 收集培養7天的DC,轉入12孔板培養，細胞濃度為2×105/ml，分別加入GMCSF（1500ng/ml）和IL4（5000U/ml），至終濃度分別為75ng/ml和250U/ml；再分別加入含pGMSurDNA質粒

13、和pcDNA質粒（對照）的轉染液（jetPEITMMacrophage）0.1ml，24h后,收集細胞，除去轉染液，繼續于GMCSF和IL4條件下培養24h，收集細胞和培養上清，提取蛋白做Western blot檢測。1.6轉染融合基因DC轉錄表達的Western blot檢測用甲醇氯仿法沉淀上清中蛋白。以2×SDS上樣緩沖液裂解細胞,提取pGMSurDCs中蛋白和pcDNA DCs中蛋白; Western blot按常規方法進行。1.7CD8+ T細胞的誘導擴增上述未貼壁的單個核細胞懸浮于10ml  10%  NCS   RPMI1640培養

14、基中，加入適量PHA，于5%  CO2、37培養3d后，再用rhIL2誘導擴增，每隔2d換液，至21d收集細胞，分別用CD3、CD4、CD8單抗標記，在流式細胞儀上鑒定細胞表型。1.8轉染GMSur融合基因DC誘導致敏CTL及其細胞毒試驗上述誘導21d的CD8+ T細胞和未誘導的Naive T細胞，懸于10%  NCS  RPMI1640培養液中，調細胞濃度為2×106/ml，接種于12孔培養板內，分別加入1×105 pcGMSur、pcDNA轉染和未轉染的DC細胞，再加入 rhIL2至終濃度為250IU/ml，于5%  CO2、37

15、混合培養45d，作為CTL效應細胞；另取呈指數生長的H29和OVCAR3細胞，用培養液調細胞濃度至1×104/ ml作為靶細胞。效靶比按2012.51比例混合，置5%  CO2、37培養2024h。然后采用LDH法檢測特異性殺傷率，并按下列公式計算特異性殺傷率：特異性細胞傷殺率(%)=效靶OD-(效應細胞自然釋放OD+靶細胞自然釋放OD)/(靶細胞最大釋放OD-靶細胞自然釋放OD)×100。2結果2.1誘導擴增DC的形態學觀察及表型經淋巴細胞分離液梯度離心，從外周血獲得單個核細胞，加入GMCSF、IL4培養24h后，可見有細胞由貼壁變為懸浮，并有少量細胞聚生，至第45d大量細胞聚集成團，第7d部分細胞形狀不規則，高倍鏡下可見有毛刺狀突起，為典型的DC形態，見圖1。培養第7d的DC，經FACS分析顯示DC不僅表達其特異性標志CD1a（25.9%），而且高表達CD80（98.4%）、CD83（97.0%）、CD