1、毛細管電泳技術在手性藥物分析中的應用摘要:手性藥物的分離近年來越來越引起世界各國的普遍關注。這是由于手性藥物引入人體,其對映異構體由人體內的手性受體、酶及蛋白以兩個完全不同的分子處理,各個對映異構體在生物環境中表現出藥物效應的種類和強度不同以及藥物吸收、分布、代謝、排泄等方面存在立體選擇性差異。對映體的一個可能是有效成分,而另一個則可能是低效無效甚至有毒。因此,開發和研究有實際應用價值的手性對映體的拆分技術以用于醫藥質量控制具有重要的現實意義。氣相色譜法(GC和高效液相色譜法(HPLC已成功用于許多對映體的拆分制備與純度測定,而毛細管電泳(CE作為二十世紀80年代才逐漸興起的一種分離分析技術已

2、逐步在藥物、生物大分子、臨床醫學等領域中得到了廣泛的應用。由于CE分離效率高、分離模式多、低耗、快捷簡便等優點,因而在手性分離中具有諸多優勢,它與GC、HPLC相互補充,顯示了巨大的應用潛力,有望成為分離分析手性化合物最為有效和最簡便經濟的方法。手性拆分有直接拆分和間接拆分兩種形式。直接拆分是指在手性環境下對對映體的直接分離;間接拆分是指先將對映體與手性光學試劑反應,生成非對映異構體之后再進行分離。關鍵詞:毛細管電泳技術手性藥物藥物分析1.前言:毛細管電泳技術確實具備特點,其主要者有:( 1 因毛細管可有效散熱而可施以高強度電場,C E的分離、分析是高效而快速的;( 2 樣品用量極少,僅需條件

3、u L至n L,耗用試劑量少;( 3 不用支持基質的FSCE 法可避免樣品與基質的作用,有利于保持生物活性;( 4 與傳統凝膠電泳相比,省略鑄膠、染色、干燥等許多操作,實驗效率大大提高,電泳系統構成了“一休化”的電泳儀;( 5 實現在線檢測后重現性和定量粘度優于傳統電泳,在某些方面可與HPLC互為補充,提供正交結果,甚至取而代之。正因為具備許多優點,CE獲得了迅速的發展。有人譽之為電泳技術的“新紀元”。然而,應該說CE仍處于繼續成長的階段。例如:分離條件的標準化,能改善定量測定重現性的最佳進樣方式,怎樣使分析系統發展為制備系統,高靈敏檢測手段的實用化,以及應用領域的繼續擴展等等,均有待進一步解

4、決。如果這些問題能逐步解決,則CE將如GC、HPLC等微量分析方法那樣,成為一種可普遍推廣的實用的常規分離和分析手段。國內對CE的研究和應用,已引起注意,但起步較晚。有些單位已引進或即將引進國外的儀器,似應加緊使用,并盡量擴大應用領域,積累經驗。少數單位已著手自行制作,或購買國外部分部件自行裝配實驗系統開展工作,這是值得提倡的。須知國外許多大學實驗室或研究所的CE先行者,都在自己制作的實驗系長統上做出成果。如能充分利用引進的和自制的儀器,加上國內的科技工作者能通過適當的渠道和適當的形式加強交流,密切協作,深信我國的毛細管電泳技術必能迎頭趕上,在這一新興技術領域的國際舞臺上占有一席之地。藥物的不

5、同手性異構體往往具有不同的藥效、毒性和藥動學性質。制藥的發展趨勢是開發單一手性異構體藥物,而目前多數藥物為外消旋體混合物。同一藥物的兩種手性異構體,其理化性質幾乎完全相同,這給手性藥物的分離帶來了很大困難。不過,手性分離可以借鑒HPLC手性分離的一些策略用手性試劑同藥物反應產生非對映異構體而分離在流動相中引入手性添加劑造成手性環境進行分離用手性固定相進行分離。在CE中不用固定相,因此只能引用前兩種方法,其中以CE底液中加入手性添加劑進行手性分離研究的較多。總之,因其分離效率很高(理論塔板數可達百萬,用于手性分離有廣闊的前景。同HPLC 手性分離相比,它具有手性添加劑用量少、不用手性柱等特點。2

6、. 毛細管區帶電泳(CZE及各類手性選擇劑CZE又稱毛細管自由電泳,是CE中最基本最普遍的一種模式。各類手性選擇劑加入緩沖液中可實現多種手性異構體的分離,且機理也各不相同。2.1 環糊精類化合物及其衍生物環糊精(cyclodextrin,CD及其衍生物是最重要的一類手性選擇劑,CD是用CD酶處理淀粉得到的化合物,目前已分離出的六聚、七聚和八聚體分別稱為:-,-,-CD。組成CD的每個葡萄糖單元均含5個手性碳原子,因此對對映異構體有較好的選擇性。手性選擇劑CD是由多個吡喃葡萄糖單元以1,4-糖苷鍵首尾相連形成的環狀低聚糖,其分子具有中空的圓臺狀結構,空腔內相對疏水,其促使對映體分離的基本原理是在

7、它們之間形成包合物。而不同包合物的穩定常數不同,從而導致分離包合物的穩定性主要決定于對映體分子的大小、極性與CD疏水空腔的匹配程度以及CD外緣的羥基與手性分子形成氫鍵的作用力的大小。在3種天然的-,-,-CD中,-CD的應用最為廣泛。可能是由于其空腔與大部分對映體相匹配,而且-CD易獲得。當CD外緣的羥基衍生化后,可以增大其水溶性,且空腔尺寸與物化性質也有所改變。衍生化后若CD外緣帶有不同取代基,則手性選擇性增強;若衍生化取代基帶電荷,則產生的靜電作用也可使手性識別能力有所增強。韋壽蓮等在以氧氟沙星、撲爾敏、特布它林和普萘洛爾為手性藥物,分別采用羥丙基-環糊精(HP-CD 、羥丙基- 環糊精結

8、合羧甲基- 環糊精(HP-CD/CM-CD作手性拆分試劑,考察環糊精濃度和pH對手性選擇性的影響。結果發現環糊精提供手性相互作用,而pH強烈地影響這種相互作用。2.2 冠醚冠醚是另一類能形成主客體配合物的拆分劑,其手性拆分主要是基于冠醚環上處于不同位置的羥基與手性對映體(主要是胺類化合物存在氫鍵作用所致。對于無紫外吸收的伯胺類手性化合物可用手性冠醚作添加劑直接進行分離后,再用間接UV 檢測方法檢測,無須衍生。冠醚不但能溶于親水性溶劑,也能溶于疏水性溶劑如苯、氯仿等,因而可將其作為非水CE的手性選擇劑用于手性分離。2.3 蛋白質生物蛋白分子與藥物分子相互作用的立體選擇性一直深受人們的重視。蛋白質

9、已成功用于CE手性分離。可作手性選擇劑的蛋白質有:牛血清蛋白(BSA、人血清蛋白(HAS、卵粘蛋白、纖維素酶、伴清蛋白、-酸性粘蛋白等。蛋白質作為手性選擇劑易產生兩個問題: (1蛋白質本身的紫外吸收將引入背景吸收值,從而影響檢測靈敏度。解決方法:管壁吸附可通過管壁涂層、加入添加劑和采用高強場等方法解決。紫外吸收可于280 nm下檢測來改善。(2重現性差。余麗寧等用人血清白蛋白分離了馬來酸曲美布汀對映體。采用柱涂層技術可降低蛋白質在毛細管壁上的吸附,使峰形和分離重現性得到明顯改善。在以蛋白質為手性選擇劑的對映體分離中通過加入有機添加劑,調節對映體與蛋白質間的疏水作用,可提高手性分離的選擇性,并改

10、善峰形。另外,除上述將蛋白質作為選擇劑加入到緩沖液中,還可將其鍵合到凝膠、硅膠或CD上用于手性分離,作手性選擇劑的最大缺點是重現性差。近來人們探索將蛋白質鍵合到7 Lm的硅膠上,在此條件下分離了安息香類鎮定劑和去甲羥基安定。用纖維素酶進行手性拆分的研究報道較少,尚處于探索階段,也有將其填充到毛細管柱內以電色譜形式進行手性分離。2.4 大環抗生素大環大分子抗生素是近年來運用并發展起來的一種非常有效的新型手性選擇劑。抗生素具有手性大環狀結構,與對映體可產生氫鍵、靜電、疏水包合等作用從而實現手性分離。大環抗生素或多或少都具有紫外吸收,為避免其對檢測的影響,通常使用濃度都在5nmol/L以下。新霉素屬

11、于氨基糖苷類抗生素,它是由新霉素B和新霉素C(質量比8515組成的混合物,由于新霉素具有易溶于水、紫外吸收低等優點,因此作為手性選擇劑分離手性化合物具有很大的潛力。2.5 多糖類化合物對多糖類化合物用作CE手性選擇劑進行研究,得出緩沖液的pH與手性選擇劑的濃度是影響拆分的主要因素。麥芽糖糊精是常用的手性選擇劑,它是D-葡萄糖以1,4-糖苷鍵相聯接的線形低聚糖。離子型粘多糖選擇劑有肝素、硫酸軟骨素、硫酸右旋糖苷等,對于離子型溶質,肝素是首選的手性選擇劑。2.6 離子絡合物將金屬離子Cu、Ni、Zn等離子和手性氨基酸形成三元金屬離子絡合物作為手性選擇劑,對映體與此絡合物中的一個手性氨基酸進行配體交

12、換形成新絡合物從而實現分離。此法常用于拆分氨基酸對映體、擬交感神經等藥物的分離。利用手性選擇性金屬絡合物對于單一的異構體分離,簡單方便,并且有良好的分離效果。但用于分離不同種類異構體的混合物時,分析的效果顯得不夠理想。3. 非水毛細管電泳(NACE非水毛細管電泳(NACE是近幾年才發展起來的毛細管電泳的一個分支,由于它有優于傳統水相毛細管電泳的許多特點,因此廣泛的應用于手性化合物的分離分析工作中。由于有機溶劑與水的物理、化學性質的不同,導致分離條件和分離機理的改變,因此對NACE分離機理的研究是十分有必要的。在非水毛細管電泳中,有兩種策略可以實現手性的分離。一是手性消除。即讓對映異構體與手性試

13、劑進行化學反應,可以使之轉變成非對應異構體。二是構建手性分離環境,就是將手性分析物加到毛細管電泳的緩沖溶液中就可以構建出不同的手性環境。后一種方法高效快速,富于變化,并且不傷害樣品。已經被普遍采用。手性環境的構建通常有三種方法:1.使用手性添加劑;2.使用手性填充毛細管;3.使用手性涂層毛細管。由于手性填充和手性涂層毛細管需要特別的制作技術,執行起來有一定的難度,而添加劑法只需要向電泳緩沖液中加入合適的手性試劑,經過一定的分離條件優化即能實現手性分離,是一種簡單實用的方法。目前對NACE 還僅僅是停留在摸索應用的階段,對其具體的分離機理的研究還很少,開發前景較大。4.小結手性藥物的生物活性與其

14、立體構型密切相關。目前新藥研究的一個發展趨勢是研制和生產光學純的藥物。手性藥物的研究已成為國際新藥研究的新方向之一,手性藥物分析在手性藥物研究中作用越來越重要,已成為國際上分析科學中的熱點和難點。目前在手性藥物分析中主要采用間接分析和直接分析。直接分析簡便、快速、準確和可靠,其中HPLC法如今占主導地位,毛細管電泳法呈上升趨勢。毛細管電泳是近20年來迅速發展起來的一種高效、快速、微量的分離分析方法。在毛細管電泳手性分析中,一般是將手性選擇劑(又稱手性添加劑加入到分離緩沖液中,提供一個手性環境,由于一對對映體與手性選擇劑的作用強弱有差異,導致各自不同的電泳淌度,從而達到手性分離。CE在手性拆分中

15、具有明顯的優勢,由于樣品用量小、分離效率高、分離速度快、靈敏度高等優點,在手性藥物分離分析中日益受到人們的關注。隨著技術的發展和各種手性選擇劑的不斷開發,手性分離技術的不斷完善,CE在手性藥物的拆分、手性對映體的鑒別、藥物光學雜質的測定、體內藥物手性分析及定量分析方法研究等方面將具有更加廣闊的發展前景。毛細管電泳目前基本靠重力進樣,因此進樣量不好控制,重現性、穩定性不好是CE的弱點。參考文獻： 1. 韋壽蓮， 鄧光輝 手性藥物的毛細管電泳拆分J 分析測試學報， 2007， 26(6： 907-910 2. 王志，孫亦梁，孫曾培高效毛細管電泳分離手性物質J分析測試學報，1996，(2： 85-9

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