1、    小鼠IL12基因轉染對人卵巢癌Skov3細胞的生長及細胞因子的表達(1)    】 目的：觀察含小鼠IL12全長基因的質粒轉染到Skov3人卵巢癌細胞中，在脾細胞存在的情況下對腫瘤細胞的影響及相關細胞因子的表達. 方法：脂質體轉染技術將基因轉染至Skov3人卵巢癌細胞中，ELISA方法檢測IL12及INF的表達，MTT方法檢測對Skov3卵巢癌細胞增殖的影響. 結果：轉染后48 h檢測到IL12的高表達，約(473±38) ng/L；而未轉染組約1317 ng/L，兩者比較差異有統計學意義（P0.

2、05）. 在脾細胞作用下產生INF，以作用后24 h表達量高，約(173±18) ng/L，較未轉染組高，比較有統計學意義(P0.05). 轉染后癌細胞免疫組化可見IL12表達，在脾細胞的作用下，IL12對Skov3卵巢癌細胞有抑制其增殖的作用(P0.05). 結論：可以將IL12基因轉染至Skov3人卵巢癌細胞中并表達IL12，脾細胞檢測其活性并有相應的細胞因子產生，對Skov3細胞有抑制其增殖作用，從而殺傷卵巢癌細胞，具有抗腫瘤作用.    【關鍵詞】 白細胞介素12；卵巢腫瘤；基因治療    0引言

3、    腫瘤生物學治療的許多細胞因子中IL12是最有效的1. 它具有明顯的抗原發和轉移瘤的作用，且毒性遠比IL2低，成為廣大學者研究的熱點之一. 卵巢惡性腫瘤在盆腔內生長，易于轉移而廣泛播散，復發率、轉移率均較高. 楊紅等2將葡萄糖醛酸苷酶基因轉入卵巢癌細胞以探索卵巢癌臨床基因治療. 我們將含有小鼠IL12全長基因的質粒轉染至Skov3人卵巢癌細胞中，觀察其表達情況及其相關細胞因子的表達，評價其抗腫瘤效果，探討臨床應用的可行性.1材料和方法    1.1材料人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌Skov3細胞株（美國Memori

4、al Sloan Kattering Cancer Center）用含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640 (Gibco公司產品)培養液，在37，50 mL/L CO2條件下培養，隔天換液，細胞長滿單層后用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代. 含有全長小鼠IL12質粒PCAGGSIL12 (7.1 kb)PCAGGSIL12P35TRESIL12P40的大腸桿菌（哈爾濱醫科大學微生物教研室）；成年KM小鼠2只，購于黑龍江省腫瘤研究所實驗動物中心；脂質體轉染試劑盒Roche公司產品.    1.2方法將已經轉化質粒PCAGGSIL12(7.1 kb)P

5、CAGGSIL12P35TRESIL12P40的大腸桿菌菌株加入LB培養基5 mL中，置于37搖床中24 h，傳代過夜，見培養基較渾濁后進行提取，-20保存并取25 L質粒溶液加入蒸餾水1 mL中，分光光度計260，280 nm下觀察A值，得到質粒的濃度和純度. DNA濃度公式：c(mg/L)=A260 nm/0.20;DNA純度公式：A260 nm/A280 nm. 將Skov3細胞制成單細胞懸液，以1×106接種于6孔板中. 貼壁后，用不含血清和抗生素的RPMI 1640培養液洗板3次，將含有質粒和脂質體的混合液（25 L 50 L=75 L）輕輕混勻放置10 min后將混合液加

6、入6孔板中，設無小鼠IL12基因的空白質粒為對照. 置37, 50 mL/L CO2孵箱中培養，6 h后更換含100 mL/L胎牛血清的培養液，于孵箱中繼續培養進行轉染. 收獲不同時間（24，48，72 h）的培養上清按小鼠IL12 ELISA試劑盒說明建立標準曲線，于轉染后24，48，60 h檢測上清IL12表達水平. 以未轉染的Skov3為對照.        取成年KM小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，加RPMI 1640培養液3 mL混勻培養，稀釋10倍后細胞記數器記數：C（個/mL）=(A B C D)/4

7、15;10×104. 吸取轉染后48 h的上清，加入脾細胞懸液中（約含1.0×106脾細胞），培養0，24，48 h，分別檢測INF表達；收集轉染后的Skov3卵巢癌細胞，將脾細胞懸液（約含1.0×106脾細胞）加入其中，共同培養24，48 h后，收集上清，檢測INF表達.以未轉染的Skov3 A值為對照MTT法檢測Skov3卵巢癌細胞抑制率=（A對照組-A實驗組）/A對照組×100%    統計學處理：全部數據經統計軟件SPSS 10.1處理，組間比較用方差分析，P<0.05為有統計學意義. &#

8、160;  2結果    質粒濃度=0.54 g/L；DNA純度：A260 nm/A280 nm=0.18. 轉染后Skov3細胞光鏡下形態未見明顯變化（圖1）.    2.1小鼠IL12的表達轉染后24，48及60 h IL12表達水平（g/L）分別為75±9，473±38，522±32；而未轉染組分別為13±4，16±4，17±6. 轉染后組IL12表達水平較未轉染組明顯增高， 48和60 h的表達有統計學差異（P0.05）.

9、60;   2.2INF的表達轉染后48 h上清與脾細胞懸液共同培養作用0，24，48 h，ELISA方法檢測得INF的表達水平（g/L）分別為：32.0±2.1，82.0±3.2，30.0±1.0，其中共同作用24 h INF表達水平較高；轉染48 h后Skov3卵巢癌細胞中加入脾細胞懸液（約1.0×106），共同培養24，48 h后，收集上清檢測INF的表達，測得INF表達水平（g/L）分別為：185.0±17.6，157.0±7.2. 轉染后的Skov3卵巢癌細胞與脾細胞共同作用24 h后可測得高水

10、平INF的表達. 提示轉染后Skov3的卵巢癌細胞持續分泌的IL12能促進效應細胞（脾細胞）產生持續高水平的INF表達. 脾細胞與轉染后Skov3的卵巢癌細胞（T Skov3 S）共同作用24 h后，A490 nm為0.735±0.036，與未轉染的Skov3卵巢癌細胞A490 nm 2.040±0.124比較有差異（P0.05）；與未轉染的Skov3 S作用后的A490 nm值2.038±0.228比較差異有統計學意義（P0.05）. 而TSkov3，Skov3，Skov3 S，Skov3組比較差異無統計學意義. 轉染后的Skov3卵巢癌細胞與脾細胞共同作用24

11、 h后，對卵巢癌的抑制率為64.0%，表明在脾細胞存在共同作用下小鼠IL12對Skov3卵巢癌細胞的增殖有明顯的抑制作用.            【關鍵詞】基因轉染Effect of mouse IL12 gene transfection on the growth of ovarian cancer Skov3 cells a         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收

12、集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。    3討論    細胞因子療法是腫瘤生物療法之一. Yamazaki等3將含有鼠IL12基因的質粒轉導到BCG中，發現能夠檢測到IL12, INF的高表達并且增加了BCG的腫瘤殺傷效應. 王克敏等4將含有小鼠IL12基因與MHCI基因的質粒采用脂質體轉染法轉染到肝癌細胞株中，用ELISA方法測得上清中小鼠IL12表達為48 ng/L. 我們以脂質體轉染技術將含有鼠全長IL12基

13、因的質粒轉染到Skov3卵巢癌細胞中，脂質體作為治療基因載體較病毒載體的優點是安全、操作簡單、轉染成功率較高,但轉染率較低，因此IL12表達水平不是特別高，較相關文獻報道水平低.    INF具有較強的抗腫瘤作用5-6, 能夠抑制腫瘤生長，并能抑制機制轉移蛋白酶，從而抑制腫瘤轉移. IL12通過誘導INF的產生，抑制腫瘤.    本實驗結果顯示在部分效應細胞脾細胞的存在下，小鼠IL12對卵巢癌細胞的抑制殺傷作用，并檢測了相應的效應因子的表達，初步探討了其在卵巢癌細胞中的抗腫瘤作用. 由于細胞因子間相互作用是一個復雜

14、的網絡，本研究中的細胞因子種類有限，不能全面解釋IL12的抗卵巢癌作用，尚需繼續完善.【參考文獻】    1 Gorelik E, Edwards RP, Feng X, et al. IL12 receptormediated upregulation of FasL in human ovarian carcinoma cellsJ. Int J Cancer, 2004, 112(4): 620-627.    2 楊紅，辛曉燕，秦衛軍. 葡萄糖醛酸苷酶基因轉染人卵巢癌細胞的生物學特性J. 第四軍醫大學學報,

15、 2003, 24（17）: 1575-1577.    3 Yamazaki M, Zhang R, Straus FH, et al. Effective gene therapy for medullary thyroid carcinoma using recombinant adenovirus inducing tumorspecific expression of interleukin12 J. Gene Ther, 2002, 9(1): 64-74.    4 王克敏，夏愛娣，陳詩書. 質脂體介導Mil12基因與MHC基因聯合對小鼠試驗性肝癌的治療作用J. 癌癥, 2002, 21（10）: 1041-1046.    5 Comes A, Carlo ED, Musiani P, et al. IFNindependent synergistic effects of IL12 and IL15 induce antitumor immune responses in syngeneic miceJ. Eur J Immunol， 2002, 32(7): 1914-1923.