1、    呼吸道合胞病毒建立哮喘動物模型中氣道膽堿能神經的分布(1)    】 目的： 用呼吸道合胞病毒(RSV)誘發豚鼠哮喘模型，通過檢測氣道反應性和氣道平滑肌層膽堿能神經分布變化，研究神經機制在哮喘發病中的作用. 方法： 34只豚鼠隨機分為4組：Hep2滴鼻生理鹽水（NS）霧化 (Hep2/NS) 組，RSV滴鼻NS霧化 (RSV/NS) 組，Hep2滴鼻雞卵白蛋白（OVA）霧化 (Hep2/OVA) 組和RSV滴鼻OVA霧化 (RSV/OVA) 組，其中Hep2/NS組和RSV/NS組動物各9只，Hep2/OV

2、A和RSV/OVA組動物各8只，以Hep2/NS組為對照組. 電刺激迷走神經法檢測氣道反應性，計數氣管粘膜和粘膜下嗜酸性粒細胞(Eos)，行膽堿能神經纖維免疫組化并計數陽性纖維數目. 結果：氣道內壓力(IP)： RSV/NS組與Hep2/NS組之間差異無統計學意義(P>0.05)，Hep2/OVA組IP明顯高于Hep2/NS組和RSV/NS組 (P均<0.05)， RSV/OVA組 IP明顯高于Hep2/OVA組 (P<0.01)；Eos：Hep2/NS組與RSV/NS組之間差異無統計學意義(P>0.05)，Hep2/OVA組高于Hep2/NS組和RSV/NS組 (P均

3、<0.05)，RSV/OVA組明顯高于Hep2/OVA組 (P<0.01)；平滑肌層有膽堿能陽性纖維分布：RSV/NS組與Hep2/NS組之間差異無統計學意義(P>0.05)，Hep2/OVA組陽性纖維數目明顯高于Hep2/NS組和RSV/NS組(P<0.01)，但RSV/OVA組與Hep2/OVA組之間差異無統計學意義(P>0.05). 結論： RSV感染可促進OVA引起的豚鼠AHR發生； OVA可導致氣道平滑肌層膽堿能陽性纖維分布增多，但RSV對其增多無明顯影響. 【關鍵詞】 呼吸道合胞病毒；哮喘；支氣管高反應性；嗜酸細胞；膽堿能纖維哮喘是困擾人類呼吸道健康的

4、主疾病之一，其發病機制錯綜復雜，至今尚未明確. 目前，大量調查研究證實呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)感染可誘發哮喘1. 動物實驗中也發現，呼吸道RSV感染后給予雞卵白蛋白(ovalbumin, OVA)霧化吸入，可導致小鼠發生明顯的氣道高反應性、肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞(eosinophils, Eos)數目增多等表現2，氣道反應性主受氣道膽堿能神經的支配. 本實驗中我們嘗試以RSV感染結合OVA霧化吸人，復制哮喘豚鼠模型，通過研究氣道膽堿能陽性神經纖維的分布狀況，探索RSV感染誘發哮喘的神經機制.1材料和方法1.1材料雌性豚鼠34只，體質量

5、250300 g (由第四軍醫大學實驗動物中心提供)；RSV Long株A型和Hep2細胞(西京醫院兒科實驗室惠贈)；RPMI 1640(美國GIBCO公司)；胎牛血清(甘肅民海生物工程有限公司)； OVA，II級(美國Sigma公司)；ChAT試劑盒(美國 Chemicon公司)；超聲波細胞粉碎機JY92II(寧波新芝科技股份有限公司)；二道生理記錄儀(甘肅國營永紅器材廠)；動物呼吸機(浙江醫科大學醫學儀器實驗廠). 1.2方法1.2.1病毒培養RSV接種于Hep2單細胞層，以含20 g/L胎牛血清的RPMI 1640為培養液， 37, 50 mL/L CO2孵育、傳代至75%以上的細胞發生

6、病變. 收集細胞，低溫超聲破碎細胞，4條件下離心10 000 g, 10 min，收集上清，分成4份，-20凍存備用.1.2.2動物分組及制模34只豚鼠隨機分為4組：Hep2滴鼻生理鹽水(normal saline, NS)霧化 (Hep2/NS) 組，RSV滴鼻NS霧化 (RSV/NS) 組，Hep2滴鼻OVA霧化 (Hep2/OVA) 組和RSV滴鼻OVA霧化 (RSV/OVA) 組， 其中Hep2/NS和RSV/NS組動物各9只，Hep2/OVA和RSV/OVA組動物各8只，以Hep2/NS組作為對照組. 乙醚吸入麻醉下給予Hep2細胞培養液或RSV懸液250 mL滴鼻吸入，第2日相同劑

7、量加強1次. 第7日開始給予1 g/mL OVA或者NS隔天霧化吸入，每次30 min，持續2 wk. 第4日各取Hep2/NS組和RSV/NS組豚鼠1只，心臟注射空氣致死，無菌條件下取肺組織，均漿，接種于Hep2細胞，觀察細胞變化情況.1.2.3氣道反應性檢測感染后第21日，豚鼠以烏拉坦1.8 g/kg腹腔注射麻醉，氣管插管，一側側孔接壓力傳感器，經二道生理記錄儀記錄氣道內壓力(intraairway pressure, IP)（cmH2O, 1 cmH2O0.1 kPa)，另一側連接動物呼吸機. 參數設置：潮氣量10 mL/kg，頻率：60次/min，記錄IP. 用蚊式止血鉗鈍性分離雙側迷

8、走神經約1 cm，結扎，剪斷，浸入石蠟油以免壞死，遠端置于保護電極上，連接電刺激器. 參數設置：頻率225 Hz，脈沖寬度0.20 ms，幅度10 V，每段刺激時間60 s，間歇時間2 min. 給予電刺激后記錄 IP的變化.1.2.4 病理學觀察主動脈穿刺，同時剪開右心耳，生理鹽水灌注沖洗，取主氣管和左肺常規40 g/L甲醛溶液固定，24 h后以300 g/L蔗糖緩沖液置換，冰凍包埋劑包埋，恒冷箱連續切片，片厚16 m，冷風干燥后，進行 HE染色，400×光鏡下隨機選10個視野，計數支氣管粘膜，粘膜下細胞總數和Eos的數目，計算每視野平均數(個/視野). 1.2.5膽堿能神經免疫組

9、化免疫組化按ChAT試劑盒中的操作步驟進行. 切片以 PBS漂洗， 100 g/L正常牛血清中室溫孵育15 min，羊抗ChAT (11000) 孵育，4過夜，再于驢抗羊血清中室溫孵育4 h，然后于1200的A，B 混合液孵育2 h，最后用DAB進行成色反應10 min，PBS漂洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，DPX封片. 陰性對照組給予抗體稀釋液代替一抗，其余同上. 以氣管分叉處氣道為分析對象，400×光鏡下圖像分析，隨機選取10個視野，測量每個視野下陽性纖維數目(條/視野).統計學處理： 采用SPSS 10.0統計軟件進行數據分析，各組間比較采用單因素方差分析及LSDt檢驗，組間方

10、差不齊時，采樣秩和檢驗. P<0.05為差異有統計學意義.    2結果2.1感染后癥狀經RSV滴鼻的豚鼠在第3日出現打噴嚏，鼻腔有少量卡他樣無色透明分泌物，其肺組織勻漿接種細胞后可觀察到細胞發生融合性病變；而用Hep2滴鼻的豚鼠無明顯呼吸道異常表現，肺組織勻漿接種細胞后觀察細胞也無明顯變化.2.2氣道反應性變化給予電刺激后各組IP均呈頻率依賴型增高. Hep2/NS組和RSV/NS組之間差異無統計學意義(P>0.05)，Hep2/OVA組IP高于Hep2/NS組和RSV/NS組(P均<0.05)，提示OVA霧化吸入可導致氣道反應性增高

11、. RSV/OVA組IP明顯高于Hep2/OVA組(P<0.01)，提示RSV感染再給予OVA霧化，可導致明顯的氣道高反應 (圖1).            【摘】目的： 用呼吸道合胞病毒(RSV)誘發豚鼠哮喘模型，通過檢測氣道反應性和氣道平滑肌層膽堿能神經分布變化         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者

12、抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。2.3膽堿能神經陽性纖維計數每個視野下Hep2/NS組，RSV/NS組，Hep2/OVA組和RSV/OVA組豚鼠氣道平滑肌層膽堿能陽性神經纖維分布為：7.20±3.07，6.80±3.29，12.80±3.07和13.80±2.76. 其中Hep2/NS組和RSV/NS組陽性纖維數目差異無統計學意義(P>0.05). Hep2/OVA組陽性纖維數目高于Hep2/NS組和RSV/NS組 (P均<0.01)， 但RSV/OVA組和Hep2/OVA組之間陽性纖維數目差異無統

13、計學意義(P>0.05，圖2).2.4細胞分類計數每個視野下Hep2/NS組，RSV/NS組，Hep2/OVA組和RSV/OVA組豚鼠氣道粘膜和粘膜下細胞總數分別為：6.83±0.87，6.55±0.90，9.36±1.14和17.11±1.64； Eos數目分別為：0.88±0.84，1.25±1.04，6.38±2.83和24.00±5.93. 其中Hep2/NS組和RSV/NS組細胞總數和Eos數目差異無統計學意義(P>0.05). Hep2/OVA組細胞總數和Eos數目均明顯高于Hep2/NS組

14、和RSV/NS組(P<0.05). RSV/OVA組出現明顯的細胞浸潤，細胞總數和Eos數均高于Hep2/OVA組，差異具有統計學意義(P<0.01).3討論近年來，哮喘的發病率和死亡率均有逐年增高趨勢，其中病毒感染為主病因之一. 成人中以鼻病毒感染為主，而嬰幼兒中則以呼吸道RSV感染最為常見3. 嬰幼兒時期感染RSV后可引起喘息、氣道高反應性等表現，預示著日后可能出現哮喘4. 氣道高反應性是哮喘的重特征，主受氣道膽堿能神經的調控. 氣道炎癥對膽堿能神經的影響直接導致氣道反應性的變化1. 直接刺激迷走神經，可以明確氣道反應性增高與迷走神經功能亢進有關，避免了氣道炎癥和其它因素的干擾

15、. RSV感染導致氣道高反應性的機制很復雜. 有研究發現RSV急性感染可導致以IFN為代表的Th1樣細胞因子上調，再次接觸過敏原可引起Th1樣細胞因子轉變為類似哮喘的Th2樣細胞因子，IL4，IL5水平上調，而IFN下調，提示RSV感染可能通過免疫炎癥機制導致氣道高反應性，從而誘發哮喘2，5. RSV感染同樣可引起氣道內感覺神經肽分泌失衡，iNANC神經功能抑制，eNANC功能亢進，從而促進氣道高反應性的發生6. 國內學者通過滅活的呼吸道RSV成功復制了哮喘動物模型，直接證實了RSV感染可以誘發哮喘7.我們的結果顯示，RSV感染末期氣道反應性恢復正常，這提示RSV感染引起的氣道高反應性為可逆的

16、改變，隨著炎癥消失而恢復正常水平. 但單純吸入OVA即引起氣道反應性增高，且這種氣道高反應性與氣道膽堿能神經功能亢進、神經纖維分布增多有關. 在吸入OVA之前感染RSV則進一步加重氣道高反應性，提示RSV感染可以促進氣道高反應性的發生. 但是值得指出的是， RSV感染并不促進氣道膽堿能神經的分布，因此其促進氣道高反應性發生的機制不是通過促進氣道膽堿能神經分布來實現的，這也為進一步研究RSV誘發哮喘的神經機制提出了新的挑戰.【參考文獻】1林耀廣. 現代哮喘病學M. 北京: 中國協和醫科大學出版社, 2004: 75-79.2Jurgen S, Mika JM, Grzegorz C, et al

17、. Transfer of the enhancing effect of respiratory syncytial virus infection on subsequent allergic airway sensitization by T lymphocytes J. J Immunol, 1999, 163(10):5729-5734.3李明才, 何韶衡. 病毒感染在誘發和加重哮喘中的作用J. 中國呼吸和危重監護雜志, 2003, 2(3): 189-192.4Piedimonte G, Simoes EA. Respiratory syncytial virus and subs

18、equent asthma: one step closer to unravelling the Gordian knot? J. Eur Respir J, 2002,20(3):515-517.5Bendejia K, Gagro A, Bace A, et al. Predominant type2 response in infants with respiratory syncytial virus (RSV) infection demonstrated by cytokine flow cytometryJ. Clin Exp Immunol, 2000, 121(2):332-338.6Dakhama A, Park JW, Taube C, et al. Alteration of